彗星电泳方法整理_精品文档Word格式.docx
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彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。
此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。
DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。
通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。
随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。
目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。
其中形状指标有彗星细胞率；
距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；
强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；
矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。
依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出，使研究人员的工作量加大。
因此，研究人员渴望开发出一种专用的彗星图像分析软件。
近年来，各国研究机构纷纷推出各自的图像分析软件，这些分析软件可以快速提供一系列评价参数，如彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等，更好地客观定量DNA损伤。
目前，用于彗星分析的软件包括英国KineticImaging公司的Komet5.5、PerceptiveInstruments公司的CometAssayⅢ、LAI公司的LACAAS、美国NIH的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奥地利癌症研究所开发的自动分析软件等。
其中的部分软件可以到其相应网站下载，但最好与相应的彗星分析系统硬件设备配套使用，价格昂贵，提高了研究成本。
新近研发的彗星分析软件（CometAssaySoftwareProject,CASP）很好地解决了这一问题，该软件可以在普通微机上运行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同时给出最多达13个指标，分析结果避免了人为误差，更加客观和准确，结果可以以.txt文件直接输出，SPSS等统计软件可以直接读取其输出结果，便于统计学分析，节省大量人力物力。
中性电泳与碱性电泳
在适合的实验条件范围内，没有损伤的细胞在中性或碱性条件都不可能做出尾巴。
中性检测DNA双链断裂，碱性检测DNA单链断裂。
根据实验设计的需要，可以选择不同的实验条件，也可以同时选择两种条件，结果进行对比。
拿电离辐射来说，中性和碱性检测的敏感范围不同，碱性SCGE的敏感范围值偏低，如可以小到0.05Gy，而中性SCGE的敏感范围值偏高，它可能检测不到0.05Gy的DNA损伤，但可以检测大到100Gy的损伤，而相对中性SCGE来说，碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台。
从修复方面来说，双链断裂的修复较单链断裂的修复慢，损伤重，后果更严重，双链断裂是后来形成染色体畸变和微核的主要物质基础。
从文献上来看，药物引起的DNA损伤多采用碱性SCGE检测单链断裂，
A：
碱性电泳是在1988年建立的，而最开始彗星方法都是在中性条件下做的（1984），所以我认为，这是方法逐步改进的过程。
碱性条件下，DNA解旋，检测出来的应该是双链和单链断裂的综合损伤，这样可以提高试验的灵敏度，也就是您说的可以检测到0.05Gy,而中性电泳做不到这一点。
B：
中性条件跑出来的是DNA的双链，单链断裂不会出来，而强碱性条件下，破坏了断裂部位连接碱基的氢键，这样，双链断裂也就成了单链形式，可以说碱性检测的是“双链和单链断裂的综合损伤”，两种电泳条件的最大区别是适用于不同的实验需求。
碱性条件的SCGE的建立也是为了满足不同实验需要。
实践中要根据DNA致伤因素选择实验条件，如：
电离辐射对DNA的损伤以双链断裂为主，应该选择中性SCGE，而且可以排除环境因素对DNA损伤的影响（因为DNA很容易受到环境因素的影响而断裂－－单链为主），如果用碱性的话，就不能区分哪些是实验因素引起的断裂，哪些是其它影响因素引起的断裂。
如果实验致伤因素是以DNA单链为主，那就应该选择碱性SCGE了。
有一点需要说明一下，碱性SCGE确实增加了检测的敏感性（中性SCGE达不到），但牺牲了特异性，DNA很容易受许多因素的影响而产生断裂，如吸烟、饮酒等不良生活习惯、环境污染等因素。
所以碱性条件很难从实验结果中剔除哪些是非实验致伤因素造成的，对实验结果会或多或少有点影响。
所以说SCGE条件的选择主要还要根据实验的需要来定。
中/碱性单细胞凝胶电泳
UnwindingoftheDNAandelectrophoresisatneutralpH（7-8）predominantlyfacilitatesthedetectionofdoublestrandbreaksandcrosslinks;
unwindingandelectrophoresisatpH12.1-12.4facilitatesthedetectionofsingleanddoublestrandbreaks,incompleteexcisionrepairsitesandcrosslinks;
whileunwindingandelectrophoresisatapHgreaterthan12.6expressesalkalilabilesites（ALS）inadditiontoalltypesoflesionslistedabove（Miyamaeetal.,1997）.
Lysisandelectrophoresiscanbeperformedinalkaline（optionA）orneutral（optionB）conditions.UseoptionAtodetectthecombinationofDNAsingle-strandbreaks,double-strandbreaksandalkali-labilesitesintheDNA,andoptionBtodetectonlyDNAdouble-strandbreaks.
一．玻片处理
1.将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20分钟。
2.用热水将肥皂等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3～5次。
必要时再置95％乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。
新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10％盐酸浸泡24小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。
3.用无水乙醇提前浸泡磨砂载玻片和盖玻片，至少过夜（用前最好预热下），再使用，可减少脱胶的问题。
4.Labelslideonfrostedendusingapencil,notapen.
二至四步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤
performedunderdimyellowlightstopreventDNAdamagethepremiseisthatusuallightingwillcauseDNAdamagebuthavenodatatosupportthisconcern.
先准备裂解液，加应用液组分溶解至清澈后放冰箱！
二．胶的配制与铺设
铺胶后都要加盖片（可不加），目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶。
表1.Samplepreparationbuffer（forplanttissueslicedwithafreshrazorblade）pH7.4
终浓度
组分
100mL
200mL
160mM
NaCl
0.9g
1.8g
8mM（25×
）
Na2HPO4
4mL
8mL
4mM（50×
NaH2PO4
2mL
50mM
Na2EDTA.2H2O
1.9g
3.8g
配胶用PBS（0.1MpH7.4）
用PBS母液配制
表2.制片用胶
10mL
保存
NMPA（0.75%）
0.75g
干燥，除湿
LMPA（0.75%）
0.075g
LMPA75uL+样品25uL，终浓度0.5%
LMPA50uL+样品50uL，终浓度0.5%
4℃保存，37-42℃操作
LMPA（0.5%）
0.05g
第一层：
0.75％正常熔点胶，100µ
l，置于室温>
5min使其固化
在烧杯里配100ml左右的正常熔点琼脂糖，煮沸之后把玻片放进去，让胶液浸过1/3之后，捞出玻片，用布或者别的什么把一面擦干，然后把玻片水平放置，晾干。
*Theslidesmaybeairdriedorwarmedforquickerdrying.Storetheslidesatroomtemperatureuntilneeded;
avoidhighhumidity（湿）conditions.Wegenerallyprepareslidesthedaybeforeuse.
*M.Klaude,S.Eriksson,J.Nygren,andG.Ahnstrom（1996）Thecometassay:
mechanismsandtechnicalconsiderations.MutationRes.363:
89-96.
第二层：
0.75％低熔点胶，75µ
l+25µ
l样品悬液，置于4℃固化1min（也可以把第二层胶配成1％，然后把细胞和胶按照1：
1的比例配，这样细胞多了，终浓度也是0.5%）
附：
三层胶法：
Gentlyslideoffcoverslipandaddathirdagaroselayer（75μLLMPA
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