免疫共沉淀原理及实验方法_精品文档Word文件下载.doc
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IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"
特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。
为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
欲速则不达，确定好比例很必要。
（待续）
二准备：
器械
#微量高速冷冻离心机
#移液枪
#旋转盘
#电泳设备
#vortex震荡器
#液氮及组织粉碎器
#eppentube
试剂
#细胞或组织
#蛋白定量kit
#SDS电泳试剂
#抗体（单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig兔血清）
#PBS
#NaN3
#proteinAsapharose
试剂配制
抗原蛋白溶解缓冲液
1.RIPA缓冲液（最终浓度）
1MTris-HCL（PH7.4）5ml（10mM）
5MNacl15ml（150mM）
0.5MEDTA（PH7.4）5ml（5mM）
20%TritonX-10025ml（1%）
10%DOC50ml（1%）
10%SDS5ml（o.1%）
TLCK18.5mg（0.1mM）
TPCK35mg（0.2mM）
DDW395ml
toal500ml
另外，使用之前加1mMPMSF（PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。
注意不易溶于水）
2.NP40lysis缓冲液
20%NP4025ml（1%）
DDW450ml
使用前加1mM的PMSF
注意点：
*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。
*反复使用PMSF要注意保管方法。
*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。
TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC<
SDS是离子性的强活性剂。
注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。
1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。
*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。
根据自己需要调节。
EDTA用NaOH滴定。
Protocol
1调制proteinAsapharose
proteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存
用单抗做一抗时，把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理（每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清）。
旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s
去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次
加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。
避免长期保存。
2．抗原的检出
以下操作全在冰面或4度进行
去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。
加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。
RIPA的量：
6cm的培养皿加1ml（蛋白质的量为500mg/ml）,组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。
30m，15000rpm离心，上清转移到新tube。
不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube
往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h
加proteinAsapharose50ul，再混匀1h
5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。
往sapharose加RIPA，vortex混匀，离心，去上清。
重复4次洗净。
加电泳用sample缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。
3.注意点
A：
不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。
对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
B：
对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。
（完）
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免疫共沉淀原理及实验方法
[SPANclass=javaid=text9766]免疫共沉淀[BR]一原理：
[BR]IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"
[BR][BR]实验最需要注意点就是抗体的性质。
[BR][BR]其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
[BR][BR]再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
[BR][BR]每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。
（待续）[BR]二准备：
[BR]器械[BR]#微量高速冷冻离心机[BR]#移液枪[BR]#旋转盘[BR]#电泳设备[BR]#vortex震荡器[BR]#液氮及组织粉碎器[BR]#eppentube[BR]试剂[BR]#细胞或组织[BR]#蛋白定量kit[BR]#SDS电泳试剂[BR]#抗体（单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig兔血清）[BR]#PBS[BR]#NaN3[BR]#proteinAsapharose[BR]试剂配制[BR]抗原蛋白溶解缓冲液[BR]1.RIPA缓冲液（最终浓度）[BR]1MTris-HCL（PH7.4）5ml（10mM）[BR]5MNacl15ml（150mM）[BR]0.5MEDTA（PH7.4）5ml（5mM）[BR]20%TritonX-10025ml（1%）[BR]10%DOC50ml（1%）[BR]10%SDS5ml（o.1%）[BR]TLCK18.5mg（0.1mM）[BR]TPCK35mg（0.2mM）[BR]DDW395ml[BR]toal500ml[BR]另外，使用之前加1mMPMSF（PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。
注意不易溶于水）[BR]2.NP40lysis缓冲液[BR]1MTris-HCL（PH7.4）5ml（10mM）[BR]5MNacl15ml（150mM）[BR]0.5MEDTA（PH7.4）5ml（5mM）[BR]20%NP4025ml（1%）[BR]TLCK18.5mg（0.1mM）[BR]TPCK35mg（0.2mM）[BR]DDW450ml[BR]toal500ml[BR]使用前加1mM的PMSF[BR]注意点：
[BR]*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。
[BR]*反复使用PMSF要注意保管方法。
[BR]*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。
TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC＆lt;
[BR]*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。
[BR]Protocol[BR][BR]1调制proteinAsapharose[BR][BR]proteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3的PBS[BR][BR]离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存[BR][BR]用单抗做一抗时，把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理（每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清）。
旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s[BR][BR]去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次[BR][BR]加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。
[BR][BR]2．抗原的检出[BR]以下操作全在冰面或4度进行[BR][BR]去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。
[BR][BR]30m，15000rpm离心，上清转移到新tube。
不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube[BR][BR]往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h[BR][BR]加proteinAsapharose50ul，再混匀1h[BR][BR]5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。
[BR][BR]加电泳用sample缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。
[BR][BR]3.注意点[BR]A：
[BR]B：
（完）[/SPA
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