原药材质量标准分析方法验证Word文件下载.docx
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分别取60℃干燥至恒重的当归及黄芪药材细粉5份，每份约0.50g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇回流提取2小时，残渣挥干溶剂后，再继续以水分别回流提取1.0h、2.0h、3.0h、4.0h、5.0h，反复洗至250ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml具塞干燥试管中，采用改良后的苯酚-硫酸法测定吸光度，计算含量，结果见表1-1。
表1-1水提不同提取时间对当归含量测定的影响结果
样品
提取时间（h）
当归多糖含量（%）
黄芪多糖含量（%）
1
1.0
7.568
5.501
2
2.0
8.599
6.511
3
3.0
8.583
6.600
4
4.0
8.594
6.589
5
5.0
8.580
6.590
从表1-1可知，水提提取时间为2.0h时，药材含量达到最大值且保持恒定，延长提取时间药材含量变化不大，故选择提取时间为2.0h。
2.1.4供试品溶液的制备
分别取60℃干燥至恒重的当归及黄芪药材细粉约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇回流提取1小时，残渣挥干溶剂后，再继续以水回流提取2小时，反复洗涤残渣及烧瓶至250ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，备用。
2.1.5最大吸收波长选择
取2.1.1项下对照品溶液，在200nm-700nm波长间进行紫外吸收光谱扫描，最大吸收波长为490nm，确定选择490nm作为检测波长。
2.1.6标准曲线的制备
精密量取对照品溶液1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。
精密量取上述各溶液1ml，置具塞试管中，分别加5％苯酚溶液0.6ml，混匀，迅速加入硫酸3.0ml，摇匀，于90℃水浴中15分钟，取出，置冰水浴中15分钟，取出，以相应试剂为空白，照紫外－可见分光光度法（附录A），在490nm的波长处测定吸光度，结果见表1-2。
以吸光度为纵坐标，葡萄糖取样量为横坐标，绘制标准曲线，可得回归方程：
y=0.0045x-0.0011，r=0.9995（n=6）。
葡萄糖在24.24～145.44μg范围内，与吸光度呈良好的线性关系，结果见图1-1。
表1-2葡萄糖线性范围考察
取样量（μg）
吸光度
24.24
0.115
48.48
0.209
72.72
0.330
96.96
0.433
121.20
0.554
145.44
0.655
图1-1葡萄糖标准曲线
Fig1-1StandardCurveofglucose
2.1.6精密度试验
精密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测吸光度，重复测定6次，求得吸光度值的RSD值为0.33%。
结果见表1-3，说明仪器的精密度符合要求。
表1-3精密度试验结果
测定次数
吸光度A
0.387
0.386
0.389
0.388
6
RSD（%）
0.33
2.1.7稳定性试验精密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作，每10分钟测定一次吸光度，到1小时后改为30分钟测一次，求得多糖含量的RSD值为1.02％，结果见表1-4，测定值在120分钟内保持稳定。
以下吸光度的测定均在120分钟内完成。
表1-4稳定性试验结果
测定时间（min）
多糖含量（％）
8.491
10
8.380
20
8.602
30
8.447
40
8.647
50
8.624
60
8.536
90
120
8.513
1.02
2.1.8重现性试验取60℃干燥至恒重的当归药材细粉6份，精密称定，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，计算多糖含量，求得多糖含量值RSD值为1.68％，结果见表1-5，表明方法重现性良好。
表1-5重现性试验结果
多糖含量（%）
8.710
8.895
8.505
8.609
8.519
平均含量
8.640
1.68
2.1.9加样回收率试验取上述已知多糖含量的当归药材细粉6份，每份约0.125g，精密称定，精密加入浓度为2.111mg/ml标准葡萄糖对照品溶液5ml按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，计算多糖含量，计算回收率，结果见表1-6。
平均回收率为99.12%，RSD值1.96%。
结果表明：
本法回收率较好，方法可行。
表1-6加样回收率试验结果
取样量（g）
样品含量（mg）
对照品加入量（mg）
实测量（mg）
回收率（％）
平均回收率（％）
0.1242
10.70
10.56
20.97
97.25
0.1256
10.82
21.61
102.18
0.1257
10.83
21.33
99.43
99.12
1.96
0.1254
10.80
21.22
98.67
0.1255
10.81
21.39
100.19
0.1250
10.77
21.01
96.97
2.1.10当归药材中多糖含量测定取60℃干燥至恒重的当归药材细粉三份，每份约0.25g，精密称定，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测定吸光度，计算多糖含量，求得当归药材中平均多糖含量为8.58％，结果见表1-7。
表1-7当归药材中多糖含量测定结果
平均多糖含量（％）
0.2501
8.44
0.2498
8.54
8.58
0.2500
8.76
2.2黄芪药材中多糖含量测定方法
本试验采用比色法对药材中的含量进行测定，建立了含量测定方法。
2.2.1对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品0.03260g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含无水葡萄糖0.3260mg）。
2.2.20.2%蒽酮-硫酸溶液的配制称取蒽酮粉末0.2g，置100ml棕色量瓶中，加硫酸至刻度，摇匀，即得。
2.2.3供试品溶液的制备[67]取黄芪药材粗粉约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水100ml，加热回流1.5h，用脱脂棉滤过，再重复提取2次，三次滤液合并，浓缩，移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。
精密量取2ml，加乙醇10ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取2ml，置10ml具塞干燥试管中，备用。
2.2.4供试品溶液制备方法的考察与确定
2.2.4.1加水量的考察取黄芪药材粗粉4份，每份约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加水50ml、100ml、150ml、200ml，加热回流1h，用脱脂棉滤过，滤液浓缩，移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。
精密量取2ml，加乙醇10ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取2ml，测定吸光度，计算含量，结果见表1-8和图1-2。
表1-8不同溶剂用量对含量测定的影响结果
加水量（ml）
4.812
100
7.874
150
7.702
200
7.774
图1-2不同溶剂用量对含量测定的影响结果
从表1-8和图1-2可知，加水量为100ml时，药材含量达到最大值且保持恒定，故选择加水量为100ml。
2.2.4.2提取时间的考察取黄芪药材粗粉5份，每份约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水100ml，分别加热回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，用脱脂棉滤过，滤液浓缩，移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。
精密量取2ml，加乙醇10ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取2ml，测定吸光度，计算含量，结果见表1-9和图1-3。
表1-9不同提取时间对含量测定的影响结果
0.5
7.598
8.125
1.5
8.597
2.5
8.585
图1-3不同提取时间对含量测定的影响结果
从表1-9和图1-3可知，提取时间为1.5h时，药材含量达到最大值且保持恒定，延长提取时间药材含量变化不大，故选择提取时间为1.5h。
2.2.4.3提取次数的选择取黄芪药材粗粉5份，每份约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水100mll，加热回流1.5h，分别再重复提取0、1、2、3、4次，用脱脂棉滤过，滤液浓缩，移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。
精密量取2ml，加乙醇10ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取2ml，测定吸光度，计算含量，结果见表1-10和图1-4。
表1-10不同提取次数对含量测定的影响结果
提取次数（次）
7.869
8.750
10.130
9.973
9.702
图1-4不同提取次数对含量测定的影响结果
从表1-10和图1-4可知，次数对多糖提取有影响，随着次数增加多糖含量上升，提取次数为三次时，药材含量达到最大值且保持恒定，增加提取次
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