细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定Word文档下载推荐.docx

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用载体克隆位点两端的引物进行PCRT增，检测插入片段大小。

随机挑选阳性重组克隆5’端测序，归并unigene，计算unigene得率，全长性判定主要根据同源全长基因5'

末端进行比较判定并计算全长率。

结果：

成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。

文库的重组率为95.04%,库容量1.13X106;

平均插入片段长度约为1.2kb。

24个随机阳性克隆测序，unigene比例为69.57%，全长性比率为

64.71%。

结论：

成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库，文库质量良好。

【关键词】细粒棘球绦虫；

成虫；

全长cDNA质粒文库；

构建；

鉴定

[ABSTRACTObjective:

Toconstructandevaluate

fullMLengthcDNAlibraryofadultEchinococcusgranulosus

（E.g.）.Methods:

mRNAwasextractedfromtheadultE.g.andusedfortheconstructionoffull拟、lengthcDNAlibraryusing

SMARTpBluescriptIISKkit.Therecombinationrateand

capabilityofthelibrarywasmeasuredandthelengthofinsertfractionofthepositiverecombinantcloneswastestedbyPCR.

Positiverecombinantcloneswererandomlyselectedfor5'

endsequencingandtheratesofunigene,full扌!

）：

lengthcDNAwas

analyzedbyESTdatausingbioinformatics.Results:

The

full松丿:

lengthcDNAlibrayofadultE.g.wasconstructedsuccessfully.Therecombinationrateandcapabilityofthelibrarywere95.04%and1.13x106,respectively.Theaveragelengthofinsertfractionwasabout1.2kb.24recombinant

clonesrandomlyselectedweresequeneed,therateofunigeneandfull拟lengthcDNAwere69.57%and64.71%.Conclusions:

Ahigh拟qualityoffullMlengthcDNAplasmidlibraryofadultE.g.hasbeenconstructedsuccessfully.

[KEYWORDSEchinococcusgranulosus;

Adult;

Full拟lengthcDNAplasmidlibrary;

Construction;

Evaluation

细粒棘球绦虫（Echinococcusgranulosus,E.g.）成虫寄生于犬科动物小肠，其中绦期幼虫细粒棘球蚴（包虫，echinococcuscyst/hydatidcyst）寄生在中间宿主偶蹄类家畜（羊、牛、马等）

及人的多种器官、组织内，引起以占位性病变为主要临床表现的囊型包虫病（cysticechinococcosis，CE，是一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人畜共患寄生虫病。

CE分布于世界许多国家的牧区，我国是CE的主要流行区之一，主要分布于西北牧区。

CE是我国乃至

世界一个重要的公共卫生及经济问题[1]，已被列入我国十一五重大寄生虫病防治项目。

疫苗及早期诊断是其防治的关键，目前尚无成熟的疫苗及诊断试剂。

该虫的基因组学及功能基因组学尚未开展，已知

基因甚少，不利于对相关基础问题的研究，更不利于相关疫苗、诊断试剂及药物的研究。

本研究目的在于通过构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库并对文库质量进行鉴定，为大规模表达序列标签（expressedsequenee

tag，EST测序，开展基因表达谱分析，克隆和鉴定一批功能基因全长cDNA序列，并为开展重要基因的功能研究打下基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

E.g.成虫标本采自青海省西宁市人工感染犬小肠，用灭菌生

理盐水漂洗3次后液氮冻存。

试剂：

Trizol总RNA提取试剂盒、1kbDNA梯度标记物为GIBCOBRL公司产品；

SMARTIV寡核苷酸，CDS

HI/3JPCR引物，pBluescriptIISK的改造载体（将EcoRI和Not

I之间的序列改造为SfiIA和SfiIB接头序列），由上海联合基

因公司合成和提供；

DH）：

5a感受态菌，通用合成引物M13+/M13：

异丙基拟B拟D）：

硫代半乳糖苷（IPTG）和x拟gal为上海生工生物工程技术有限公司产品；

质粒抽提试剂盒，荷兰QIAGEN公司产品；

DYEnamicTMETDYETerminatorKit（MegaBACETM为美国AmershamBiosciences产品；

Milli拟Q水纯化系统，美国Millipore公司产品；

SpectraMaxPlus384连续波长酶标仪，美国MolecularDevices公司产品；

F^D；

280电泳仪，上海复日公司产品；

HYBAIDPCREXPRESS

PCF仪，英国ThermoHybaid公司产品；

ABIPRISM3700测序仪，美国PEABI公司产品。

1.2方法

1.2.1全长cDNA质粒文库的构建

121.1样品总RNA抽提及mRN纯化

按提取试剂盒操作说明书抽提总RNA产物，于260nm及280nm测吸光度（A260及A280），计算A260/A280比值判定纯度（纯RNAA260/A280=1.9-2.1），1.1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。

根据QIAGEN^司的OligotexmRNAKits操作说明书进行分

离，A260及A280检测及1.1%琼脂糖电泳检测抽提结果。

1.2.1.2cDNA第一链合成

0.5mL灭菌离心管中加入以下试剂：

2卩g样品RNA1卩LSMART

IVOligonucleotide，1卩LCDSIII/3'

PCRPrimer，加水补足5

卩L，混匀试剂并稍离心，72C温浴2min，冰浴2min，稍离心后加入下列试剂：

2.0卩L5xFirst拟StrandBuffer,1.0卩LDTT（20mmol/L），1.0卩LdNTPMix（10mmol/L）,1.0卩LPowerScriptReverseTranscriptase，总反应体系为10.0卩L,混匀试剂并稍离心，42C温浴1hr，将离心管置于冰上终止第一链合成。

1.2.1.3LDPCR扩增cDNA

将PCF仪预热至95C，反应管中加入下列试剂：

2卩LcDNA第一链，80卩L去离子水，10卩L10xAdvantage2PCRBuffer，2卩L50xdNTPMix2□L5'

PCRPrimer，2LCDSIII/3'

PCRPrimer，2□L50xAdvantage2PolymeraseMix，总反应体系100卩L。

轻拍混匀，稍离心后置于已预热PCF仪，按下面程序开始PCR95C1min，26cycles;

95C15sec，68C6min。

循环结束后取5卩L样品1.1%琼脂糖电泳检测。

1.2.1.4PCR产物纯化

合并LDU.PCF产物至0.5mL菌离心管中，加入2卩L蛋白酶K（20卩g/卩L），混匀试剂并稍离心，45C温浴20min，离心，加入50卩L去离子水，100卩L酚：

氯仿：

异戊醇抽提，17530Xg离心5min，收集上层液体转移至另一干净离心管中，加入等体积的氯仿：

异戊醇

混匀，离心5min，转移上层液体，加入1/10体积3mol/L乙酸钠，2.5倍体积95%室温乙醇，室温条件下立即17530Xg离心20min，去上清，100卩L80%乙醇洗沉淀物，空气干燥约10min，加79卩L去离子水溶解沉淀。

1.2.1.5SfiI消化

0.5mL离心管中加入下列试剂：

79卩LcDNA,10卩L10xSfi

Buffer,10卩LSfiIEnzyme,1L100xBSA加去离子水补充体

积至100卩L。

充分混匀，50C温浴2h。

加2卩L1%二甲苯胺染料。

121.6cDNA的分级分离

备11个收集管，700卩L缓冲液清洗spin拟400柱子后将酶切产

物约100卩L平稳加于胶层中间，直至产物全部渗到胶面下。

加100卩L缓冲液使染料层下降数毫米，放置好第一收集管。

加600卩L缓冲液并开始收集滴出液体，每管收集35卩L。

合并第2〜7管，拟.20C乙醇沉淀过夜。

17530Xg离心20min，弃上清，室温干燥10min，加7口L去离子水溶解沉淀，1.1%琼脂糖电泳检测。

1.2.1.7cDNA与pBluescriptIISK改良载体相连

反应管中加入下列试剂：

1.0卩LcDNA，1.0卩LVector（25

ng/mL），1.0卩L10xLigationBuffer，1.0卩LATP（10mmol/L），1.0□LT4DNALigase，加去离子水5.5卩L至10.0卩L，16CPCR仪上过夜。

1.2.1.8重组质粒的转化

按常规方法取1卩L连接液转化200卩L感受态大肠埃希菌DH'

5

a。

1.2.2文库质量的鉴定

1.2.2.1质粒文库的容量及重组率

转化后的菌液涂布于15cm培养皿（Apr拟IPTG/x拟galLB固体培

养基），37C过夜。

计数菌落总数和蓝色菌落数，计算质粒文库的容量和重组率。

重组率二（菌落总数拟蓝色菌落数）/菌落总数X100%库容量二菌落数X连接产物量。

1.222插入片段大小

随机挑取12个阳性克隆，以通用载体引物M13+般PCR扩增，

扩增产物1.1%琼脂糖凝胶电泳，计算插入片段平均长度。

1.2.2.35'

端EST测序及测序结果的unigene、全长性判定随机挑取24个阳性克隆，送上海联合基因科技有限公司进行测序。

＞450bp的序列作为有效序列，使用Washington大学wU以blast程序（2.0a19MP）对测序结果进行同源性分析。

依据100bp95%勺标准进行归并为