细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定Word文档下载推荐.docx

1、用载体克隆位点两端的引物进行 PCRT增，检测插入片段大小。 随机挑选阳性重组克隆5端测序，归并unigene，计算unigene得 率，全长性判定主要根据同源全长基因 5末端进行比较判定并计算 全长率。结果：成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。文库的重组 率为95.04%,库容量1.13 X 106 ;平均插入片段长度约为1.2kb。24 个随机阳性克隆测序， unigene比例为69.57%，全长性比率为64.71 %。结论：成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库，文库质量良 好。【关键词】 细粒棘球绦虫；成虫；全长cDNA质粒文库；构建；鉴定ABSTRACT Objective:

2、 To con struct and evaluatefull M Le ngth cDNA library of adult Echi no coccus gra nul osus（E.g. ） . Methods:mRNA was extracted from the adult E.g. and used for the con structi on of full 拟、le ngth cDNA library usingSMARTpBluescript II SK kit. The recombination rate andcapability of the library was

3、measured and the length of insert fracti on of the positive recomb inant clones was tested by PCR.Positive recomb inant clones were ran domly selected for 5 end seque ncing and the rates of unigene, full 扌!）：le ngth cDNA wasanalyzed by EST data using bioinformatics. Results: Thefull 松丿:length cDNA l

4、ibray of adult E.g. was constructed successfully.The recomb in ati on rate and capability of the library were 95.04% and 1.13 x 106, respectively.The average len gth of insert fracti on was about 1.2kb. 24 recomb inantclones ran domly selected were seque need, the rate of unigene and full 拟 le ngth

5、cDNA were 69.57% and 64.71%. Con clusio ns: A high 拟quality of full Mlength cDNAplasmid library of adult E.g. has bee n con structed successfully.KEY WORDS Echinococcus granulosus;Adult;Full 拟length cDNA plasmid library; Construction; Evaluation细粒棘球绦虫（Echi nococcus granu losus , E.g.）成虫寄生于 犬科动物小肠，其中

6、绦期幼虫细粒棘球蚴（包虫， echi nococcus cyst/hydatid cyst ）寄生在中间宿主偶蹄类家畜（羊、牛、马等）及人的多种器官、组织内，引起以占位性病变为主要临床表现的囊型 包虫病（cystic echinococcosis ，CE，是一种严重危害人类健康和 畜牧业生产的人畜共患寄生虫病。CE分布于世界许多国家的牧区， 我国是CE的主要流行区之一，主要分布于西北牧区。 CE是我国乃至世界一个重要的公共卫生及经济问题 1 ，已被列入我国十一五重大 寄生虫病防治项目。疫苗及早期诊断是其防治的关键，目前尚无成熟 的疫苗及诊断试剂。该虫的基因组学及功能基因组学尚未开展， 已知基因

7、甚少，不利于对相关基础问题的研究，更不利于相关疫苗、诊断 试剂及药物的研究。本研究目的在于通过构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库并对 文库质量进行鉴定，为大规模表达序列标签（ expressed seque neetag，EST测序，开展基因表达谱分析，克隆和鉴定一批功能基因全 长cDNA序列，并为开展重要基因的功能研究打下基础。1材料与方法1.1材料与试剂E.g.成虫标本采自青海省西宁市人工感染犬小肠， 用灭菌生理盐水漂洗3次后液氮冻存。试剂：Trizol总RNA提取试剂盒、1 kb DNA梯度标记物为GIBCO BRL公司产品；SMART IV寡核苷酸，CDSHI/3JPCR 引物，pB

8、luescript II SK 的改造载体（将 EcoR I 和 NotI之间的序列改造为Sfi I A 和Sfi I B 接头序列），由上海联合基因公司合成和提供；DH）：5 a感受态菌，通用合成引物 M13+/M13：, 异丙基拟B拟D）：硫代半乳糖苷（IPTG）和x拟gal为上海生工生物工 程技术有限公司产品；质粒抽提试剂盒，荷兰 QIAGEN公司产品；DYEnamicTMET DYETerminator Kit （MegaBACETM为美国 Amersham Biosciences产品；Milli拟Q水纯化系统，美国Millipore 公司产品； SpectraMax Plus384

9、连续波长酶标仪，美国 Molecular Devices 公 司产品；FD；280电泳仪，上海复日公司产品； HYBAID PCR EXPRESSPCF仪，英国Thermo Hybaid公司产品；ABI PRISM 3700测序仪，美 国PE ABI公司产品。1.2方法1.2.1全长cDNA质粒文库的构建121.1 样品总RNA抽提及mRN纯化按提取试剂盒操作说明书抽提总 RNA产物，于260nm及280nm测 吸光度（A260及A280），计算A260/A280比值判定纯度（纯RNAA260/ A280=1.9-2.1），1.1%琼脂糖电泳检测 RNA完整性。根据QIAGEN司的Oligot

10、ex mRNAKits操作说明书进行分离，A260及A280检测及1.1%琼脂糖电泳检测抽提结果。1.2.1.2cDNA 第一链合成0.5mL灭菌离心管中加入以下试剂：2卩g样品RNA 1卩L SMARTIV Oligo nucleotide ，1 卩 LCDS III/3 PCR Primer，加水补足 5卩L，混匀试剂并稍离心，72C温浴2min，冰浴2min，稍离心后加入 下列 试剂：2.0 卩 L 5 x First 拟Strand Buffer , 1.0 卩 L DTT （20mmol/L），1.0 卩 L dNTP Mix （10mmol/L） , 1.0 卩 L PowerSc

11、ript Reverse Transcriptase ，总反应体系为 10.0卩L,混匀试剂并稍离 心，42 C温浴1hr，将离心管置于冰上终止第一链合成。1.2.1.3LD PCR 扩增 cDNA将PCF仪预热至95C，反应管中加入下列试剂：2卩L cDNA第一 链，80 卩 L 去离子水，10 卩 L 10x Advantage 2 PCRBuffer ，2卩 L 50 x dNTP Mix 2 L 5 PCR Primer，2 L CDS III/3 PCR Primer， 2 L 50 x Advantage 2 Polymerase Mix，总反应体系 100 卩 L。轻拍 混匀，稍

12、离心后置于已预热PCF仪，按下面程序开始PCR95C 1min， 26cycles;95 C 15sec，68C 6min。循环结束后取 5卩 L 样品 1.1% 琼脂糖电泳检测。1.2.1.4PCR产物纯化合并LDU.PCF产物至0.5mL菌离心管中，加入2卩L蛋白酶K（ 20 卩g/卩L），混匀试剂并稍离心，45 C温浴20min，离心，加入50卩L 去离子水，100卩L酚：氯仿：异戊醇抽提，17530X g离心5min， 收集上层液体转移至另一干净离心管中，加入等体积的氯仿 ：异戊醇混匀，离心5min，转移上层液体，加入1/10体积3mol/L乙酸钠， 2.5倍体积95%室温乙醇，室温条

13、件下立即 17530Xg离心20min， 去上清，100卩L 80 %乙醇洗沉淀物，空气干燥约 10min，加79卩L 去离子水溶解沉淀。1.2.1.5Sfi I 消化0.5mL离心管中加入下列试剂： 79卩L cDNA, 10卩L 10 x SfiBuffer , 10 卩 L Sfi I Enzyme , 1 L 100 x BSA 加去离子水补充体积至100卩L。充分混匀，50C温浴2h。加2卩L 1%二甲苯胺染料。121.6 cDNA 的分级分离备11个收集管，700卩L缓冲液清洗spin拟400柱子后将酶切产物约100卩L平稳加于胶层中间，直至产物全部渗到胶面下。加 100 卩L缓冲

14、液使染料层下降数毫米，放置好第一收集管。加 600卩L缓 冲液并开始收集滴出液体，每管收集35卩L。合并第27管，拟.20C 乙醇沉淀过夜。17530Xg离心20min，弃上清，室温干燥10min，加 7 口 L去离子水溶解沉淀，1.1%琼脂糖电泳检测。1.2.1.7cDNA 与 pBluescript II SK改良载体相连反应管中加入下列试剂： 1.0卩L cDNA，1.0卩L Vector （25ng/mL）， 1.0 卩 L 10 x Ligation Buffer ， 1.0 卩 L ATP （10mmol/L）， 1.0 L T4 DNA Ligase，加去离子水 5.5 卩 L

15、至 10.0 卩 L，16C PCR 仪上过夜。1.2.1.8重组质粒的转化按常规方法取1卩L连接液转化200卩L感受态大肠埃希菌DH,5a。1.2.2文库质量的鉴定1.2.2.1 质粒文库的容量及重组率转化后的菌液涂布于15cm培养皿（Apr拟IPTG/x拟gal LB固体培养基），37C过夜。计数菌落总数和蓝色菌落数，计算质粒文库的容 量和重组率。重组率二（菌落总数拟蓝色菌落数）/菌落总数X 100% 库容量二菌落数X连接产物量。1.222 插入片段大小随机挑取12个阳性克隆，以通用载体引物 M13+般PCR扩增，扩增产物1.1%琼脂糖凝胶电泳，计算插入片段平均长度。1.2.2.35 端EST测序及测序结果的unigene、全长性判定 随机挑取24个阳性克隆，送上海联合基因科技有限公司进行测 序。450bp的序列作为有效序列，使用 Washington大学wU以blast 程序（2.0a19MP）对测序结果进行同源性分析。依据 100bp 95%勺标准 进行归并为