用于肿瘤基因治疗的慢病毒载体研究进展文档格式.docx

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　　1LV的基因结构[1～3]

　　人类免疫缺陷病毒直径110～120nm，呈20面体对称结构，大致呈球形。

病毒外膜是磷脂双分子层，来自宿主细胞，膜上有表面蛋白（gp120）与镶嵌蛋白（gp41）;

gp41是跨膜蛋白，gp120为刺突，并与gp41通过非共价作用结合。

包膜内面是蛋白P17形成的球形基质蛋白（Matrix），以及衣壳蛋白（p24）形成的半锥形衣壳（Capsid），衣壳在电镜下呈高电子密度。

衣壳内含有病毒的RNA基因组和其他来自宿主细胞的成分（如tRNAlys3，作为逆转录的引物）。

　　病毒基因组是两条相同正股RNA链，全长约9200bp。

两端是长末端重复序列（LTR），含顺式调控元件,序列为5′U3RU53′，控制前病毒的表达。

现已证明，在LTR有启动子和增强子并含负调控区。

LTR之间的序列至少编码9个蛋白，可分为3类：

结构蛋白、调控蛋白、辅助蛋白。

结构蛋白Gag、Pol、Env基因编码。

gag基因产生相对分子质量55000的蛋白P55。

P55病毒编码的一个蛋白切成4个小蛋白：

MA（P18基质蛋白）、CA（P24衣壳蛋白）、NC（P7核衣壳蛋白）及P6。

GagPol融合蛋白病毒编码的一个蛋白切为4个小蛋白：

RT（P50逆转录酶）、RNaseH（P15RNAH）、IN（P31整合）及Pro（P10蛋白）。

Env起先是相对分子质量160000的蛋白,在感染宿主细胞之后，宿主细胞将gp160切为gp41与gp120。

调控蛋白tat、rev基因编码,Tat和Rev蛋白分别在转录及转录后水平对病毒基因表达进行调节。

辅助蛋白4个辅助基因vpu、vpr、vif、nef编码。

MAN、IN和vpr这3种分子元件决定了LV载体能转导非分裂期细胞。

这3类蛋白利用细胞核的输入机制，靶向作用于细胞核的前整合复合物（PIC）。

细胞核的输入系统包括：

胞质蛋白、importina、importinb及核孔蛋白。

importina含有一个细胞定位序列（NKS）的结合位点，当含有NL的蛋白与importina结合发生构象变化，与importinb相互作用，然后importinb通过与核孔蛋白结合，靶向作用于核孔复合物[4]。

而在实际构建时，vpr可以完全敲除而不影响LV载体感染非分裂期细胞的能力。

　　2LV载体系统的演进

　　对LV载体进行改造使其具有高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性一直是研究的热点。

到目前为止，已有3代LV载体产生。

第一代LV载体以人的HIVⅠ研究最为广泛。

保留顺式作用元件包括病毒本身的LTR以及病毒的包装信号ψ、Gag基因部分p17区域、Rev反应元件（RRE）。

应用限制性内切酶等工具逐渐去除掉野生型LV复制所需要的Gag、Pol、Env基因，部分除掉vpu、vpr、vif、nef致病基因，以保证载体的生物安全性。

于这种载体已经缺少形成完整病毒所需要的蛋白基因，所以它不能依靠自身基因形成完整的病毒颗粒[5]。

而后将编码病毒衣壳和包膜结构的基因分别克隆于另外两个质粒中，一个表达Gag和Pol,另一个表达Env,即转移质粒、包膜表达质粒和辅助质粒。

转移质粒带一个强启动子，如CMV启动子用来控制除Env以外所有病毒结构基因的表达，它还保留了病毒的LTR区并且被插入了外源基因，在转移质粒上人工插入标记基因（如LacZ、NeuoR、Gpt、Gfp）并可以在标记基因之后外源基因插入之前引入内部核糖体进入位点（IRES），这样就可以一个启动子来转录出一个双顺反子mRNA，而不同的核糖体来分别翻译出两种蛋白。

第一代LV载体系统的特点是在构建3种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒（RCV）的可能性，尽可能减少3种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留了HIV的辅助基因。

第二代LV载体在生物安全性上作了大量的改进，包装结构基因质粒上进一步删去了编码辅蛋白Nef、Vif、Vpr的基因[6]，只保留了gag、pol、tat、rev，生物安全性进一步提高。

第三代LV载体的主要特征是构建了自我失活型的质粒（删除了病毒3′端LTR上的U3）。

因为在病毒整合宿主基因组后，病毒3′端LTR的U3发生跳跃后能启动病毒基因的转录。

而U3是病毒的启动子，当删除病毒3′端LTR的U3后，病毒基因组就不能复制，即使在发生病毒基因与宿主基因重组的情况下，病毒的基因组也不能被复制，因此只能转录整合目的基因，消除了产生活性病毒的可能性[7]。

另一种改进是在LV载体包装结构基因质粒上进一步删去了tat基因。

总之，第三代LV在不影响感染能力的前提下，其生物安全性大大提高。

　　3三质粒表达系统

　　根据以上原理，NALDINI等[8]和KAFRI等[9]构建了三质粒表达系统。

三质粒系统是包装质粒、包膜质粒及转移质粒组成的。

其中包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIVⅠ复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白Vpu;

包膜蛋白质粒使用水疱性口炎病毒G蛋白（VSVG）等异源性基因代替env基因，HIVⅠ载体的感染谱得以扩大，HIVⅠ载体颗粒获得高度稳定性并可在转移质粒中插入标志基因（绿色荧光蛋白GFP）;

转移质粒上还可以插入需要转入靶细胞的目的片段。

通过三质粒共转染293T细胞,就可以生产复制缺陷的HIV病毒。

　　4LV的基因治疗

　　肿瘤基因治疗是继手术、放疗等传统治疗方法之后出现的一种全新的肿瘤治疗方法。

LV载体能够将肿瘤治疗基因安全高效地转移到人体内，使治疗基因长期、稳定、高效的表达。

目前在基础和临床方面取得了许多进展。

　　TRONO[10]认为重组LV载体是目前最适合神经系统退行性疾病基因治疗的载体系统。

LV载体安全高效的特点使其在神经系统疾病中的应用越来越广泛[11]。

杨宇等[12]采用目前安全性最高的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组LV载体;

Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达。

目前,体内外实验中均未发现LV载体对正常组织细胞有毒副作用,不编码病毒蛋白,在中枢神经系统内不引起免疫反应[13]。

马晓生等[14]研究显示，LV载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体，并成功构建含hBMP2基因的LV载体，收集到有活性的能表达目的蛋白的重组LV,为今后用于临床骨缺损基因治疗方面的研究提供了重要的理论依据和材料。

作为基因治疗中常用的靶细胞，T淋巴细胞是处于非分裂期的细胞,在移植物抗宿主病等疾病中起到重要的作用。

提高目的基因对T细胞的转导效率对于这类疾病基因治疗具有重要的意义,这是目前研究的重点和难点。

李振宇等[15]构建了以HIVⅠ为基础的LV三质粒系统,并以绿色荧光蛋白基因（GFP）作为标志基因,观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。

感染小鼠T淋巴细胞48h后,荧光显微镜下观察到T淋巴细胞内含有绿色荧光,证实GFP基因在其中表达,FACS分析转导效率为（±

）%,较同样条件下逆转录病毒载体感染小鼠T淋巴细胞的效率（±

）%[16]为高（P<

）。

林健等[17]成功利用LV介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVTK）基因转导大鼠胶质瘤细胞，为后续的脑胶质瘤基因治疗提供了可靠基础。

　　造血干细胞是一种具有自我更新能力和多分化潜能的细胞，被认为是基因治疗中最有发展前景的靶细胞。

MAY等[18]证实LV载体能够将目的基因转移到靶细胞中，并能在其中长期表达。

　　5存在问题及展望

　　尽管HIVⅠ载体研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。

首先，重组病毒滴度还不够高，难以达到体内应用的需要;

其次，于HIV复杂的生物学性质，要像目前常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困难，已建立的包装细胞均不理想[19,20]。

研究报道，Vpr是一种使细胞进入静止期的强诱导剂[21]，也是建立包装细胞的主要障碍之一。

如果去除包装质粒中的vpr基因而不影响载体的转导能力，则可以建立稳定的包装细胞。

　　LV载体技术是目前转基因中最有效和最成功的方法，其技术操作简便，能高效地将目的基因以单拷贝的形式插入宿主染色体中，基因表达效率高，对宿主细胞功能系统有良好的适应性。

相信该载体会对医学的发展产生重要的意义。

　　[2]HAASEAT.Viralgeneexpressionandpathogenesisinthreeemergingdiseases:

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HTLVⅠandHAM/TSP;

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　　[3]ZAULIG,GIBELLINID.Hehumanimmunodeficiencyvirustype1（HIV1）TatproteinandBcl2geneexpression[J].LeukLymphoma,1996,23:

551560.

　　[4]GORLICHD,MATTAJIW.Nucleocytoplasmictransport[J].Science,1996,5:

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　　[5]THESLEFFIA.Theroleofgrowthfactorsintoothdevelopment[J].IntRevCytol,2002,217:

93135.

　　[6]ZUFFEREYR,NAGYD,MANDELRJ,etal.Mutiplyattenuatedlentiviralvectorachievedefficientgenedeliveryinvivo[J].NatBiotechnol,1997,15（9）:

871875.

　　[7]SCHERRM,EDERM.Genetransferintohematopoieticstemcellsusinglentiviralvectors[J].CurtGeneTher，2002，2

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　　[8]NALDINIL,BLOMERU,GALLAYP,etal.Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector[J].Science,1996,272:

263267.

　　[9]KAFRIT,BLOMERU,PETERSONDA,etal.Sustainedexpressionofgenesdelivereddirectlyintolivera