酵母菌感受态制作及转化_精品文档Word文档格式.doc
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2)至OD600>1.5,1:
10转接,此时OD600≈0.3;
3)30℃,250rpm,4-7h,每2h检测一次,直到OD600=0.4-0.6;
4)转入2个50ml离心管,5100rpm,5min,弃上清;
5)加入1/2VddH2O,洗涤细胞,5100rpm,5min,弃上清;
6)每管中分别加1ml1×
TE/LiAc,冰上混匀,10000rpm,15s,去上清;
7)每管中分别加0.5ml1×
8)每管中分别加0.5ml1×
9)每管中分别加0.4ml1×
TE/LiAc,每管100ul分装;
10)分别加入100ng左右DNA(plasmid)和0.1mg鲑鱼DNA(10mg/ml,10ul),移液器抽吸混匀溶液;
11)分别加入600ulLiAc/PEG,高速混匀(10s-1min内);
12)30℃摇床恢复30min;
13)超净台(无菌条件下)加入70ulDMSO,轻轻颠倒混匀;
14)42℃热激15min;
15)冰上放置1-2min;
16)14000rpm,15s,去上清;
17)300ulTE重悬细胞;
18)100ul/1ul分别涂布于YPDA平板;
100ul/1ul分别涂布于SD/-Trp单缺陷平板;
100ul/1ul分别涂布于SD/-Trp/-His双缺陷平板上,30℃倒置培养48-72h可见转化菌落。