DNA多态性及其分析优质PPT.ppt

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杂合子：

在一定的座位上带有两个不同的等位基因的个体。

（一般是针对所研究的一对或几对基因而言。

）,多态性：

发生遗传分离的基因座位（locus）具有两个以上等位基因时，其最常见的等位基因的频率不超过0.95或0.99时，这个基因座位就被认为具有多态性。

个人一对等位基因（如1/2，或2/3）人群复等位基因（如1、2、3、4）,如ABO血型基因、人类白细胞抗原基因二态性（dimorphism）：

在某些时候，一个基因位点上只由一个基因占据，但有时这个位置上缺乏这一基因，这时就会出现“有”和“无”两种情况，被称为二态性。

遗传多态性广泛存在于生物界。

果蝇有着大量的蛋白质水平上的遗传变异哺乳动物的免疫球蛋白有高度的遗传多态性即使是纯系的小鼠，其免疫球蛋白IgG2a重链编码区1108个碱基中就有110个（10%）的碱基组成互不相同，其中有18个碱基替换是同义的，其余的变异则编码不同的氨基酸。

三分类,遗传表型的多态性,DNA的多态性,由遗传控制表现出来的性状就是遗传表型红细胞表面的抗原多态性系统：

有ABO、Rh等20余种人类白细胞抗原（HLA）系统人类的免疫球蛋白,性状：

生物体表现出的形态特征（如花色）和生理生化特征（如抗病性、合成某种物质的能力）。

表型：

个体所具有的全部或部分性状。

是基因型与环境作用的结果。

人30亿碱基（bp）,基因及相关序列20%30%编码序列10%检测表型多态性,非基因序列7080%,中度或高度重复序列20-30%单一或低拷贝序列70-80%,在所有生物体的基因组中都存在着天然的DNA序列变异由于基因组的大多数序列不编码蛋白质，因此可容纳大量的序列变异估计在人群个体之间每200400个核苷酸就能检测到一个核苷酸的变异。

某一变异的群体频率达到或超过1%即被认为属DNA多态性。

遗传表型的多态性只反映出编码基因的部分变异DNA序列中的同义突变不会引起表型的改变基因的表达也会有变异：

环境作用从基因到基因产物会受到许多因素的影响，而改变最终产物。

分析DNA的多态性才能真正深刻地揭示生物的多态性,第二节DNA多态性的分类,一基因多态性二重复序列多态性三性染色体多态性四线粒体的DNA多态性,一基因多态性,基因的多态性遗传表型的多态性在生物群体中，对于某一基因座位来说，属于这一位点的等位基因越多，这一座位的基因多态性就越复杂。

HLA白细胞抗原系统：

仅HLA-DR抗原的编码位点就有HLA-DRA，-DRB1，B2，B3，B4，B5等10个座位，超过200个等位基因。

二重复序列多态性,串联重复序列相同的核心序列（coresequence）按首尾相接的方式排列。

在重复序列两翼，DNA片段的碱基组成相同,限制性内切酶,不同长度的DNA片段,GATC,GATC,GATC,GATC,1,2,B,A,ssDNA探针,大片段小片段,

（1）不同个体核心序列重复的次数不同

（2）不同的串联重复序列，其核心序列的组成会不同（3）在核心序列之间，有时不同的个体间会存在有无插入小段的DNA序列或插入的片段长短不同之差,DNA指纹,由于不同的个体其核心序列重复的次数不同，应用限制性内切酶酶切时，形成不同长度的DNA片段，这类多态性被称为VNTR（variablenumbersoftandemrepeats，VNTR），可变数串联重复序列多态性。

两个无关个体之间的VNTR的变异能达到完全个体特异的程度,小卫星DNA（minisatelliteDNA）:

串联重复序列中有一类较短的，称为。

许多基因的内含子部分含有此类序列。

特点：

GC含量高插入或缺失此类序列的事件发生频繁，有时还会发生跳跃复制的现象。

1985年，Jeffreys等首先用人肌红蛋白基因内含子中一段高度重复的小卫星DNA为探针，获得了具有个体特异性的DNA指纹图谱。

中度重复的散在重复序列：

散在重复序列的某些重复单位可能是转座子（transposon）。

一种能够反复插入到基因组中许多位点的特殊DNA片段。

它可以从基因组上一个位点转移到另一个位点，从一个复制子转移到另一个复制子。

三性染色体多态性,X染色体着丝粒周围也有一类重复序列形成X染色体的VNTR类多态性。

Y染色体在哺乳动物的染色体中Y染色体似乎是最少保守性的。

用不同的限制性内切酶和DNA探针，可以揭示出Y染色体特异性片段的多态性。

四线粒体的DNA多态性,线粒体DNA属于核外基因，表现为非孟德尔规律遗传。

人mtDNAD环一端347bp的序列分析资料证明，两个无关个体间，这一段mtDNA序列完全相同的可能性只有0.27%（即1/370）。

因此，mtDNA序列组成的多态性同样可以用作个体识别。

SNP单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

它是人类可遗传的变异中最常见的一种。

占所有已知多态性的90%以上。

SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

第三节DNA多态性分析技术,1979年，Jeffreys等人首先用限制性内切酶和-珠蛋白基因探针直接观察到DNA的多态性。

即限制性片段长度多态性技术。

1985年，Mullis等发明了聚合酶链反应（polymerasechainreaction，简称PCR）技术，对DNA多态性的分析。

一RFLP分析技术,

（一）基本原理限制性酶切片段长度多态性技术，简称RFLP技术（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）,1.限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能将之切断。

不同的限制性内切酶有各自特异的识别序列，一般为48个碱基对。

2.DNA区段碱基组成不同。

用一种限制性内切酶消化，就会产生不同长度的酶切片段。

A含1,2两个酶切位点的DNA片段B点突变使酶切位点1缺失C点突变产生酶切位点3D序列重排使酶切位点2移位E含有酶切位点2的片段缺失F序列插入，如存在数量不同的串联重复序列，即VNTR,1,2,1,2,2,3,1,2,1,1,2,采用合适的限制性内切酶切出一系列长度的DNA片段根据片段是否长度一致来推测其DNA序列是否相同用标记好的相应的DNA探针与这些片段进行杂交图谱反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。

RFLP通过核酸的限制性酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的不同，因而称为限制性酶切片段长度多态性技术。

（二）RFLP技术的基本步骤,抽提DNA（从血或组织）培养细菌人工合成探针限制性内切酶消化质粒纯化纯化探针琼脂糖凝胶电泳标记探针（同位素或非同位素）Southern转移、固定预杂交杂交洗膜放射自显影或显色后分析结果RFLP技术的基本步骤,靶DNA的准备,核酸探针的标记,杂交显示,正常人染色体DNA含有4个完全一样的-珠蛋白基因，而-地中海贫血患者则缺失一个或数个-珠蛋白基因用-珠蛋白基因探针对患者或产妇进行RFLP分析：

当用EcoRI和HpaI酶切后，正常人标本出现4.8、4.1kb两条杂交带；

患者仅出现5.6kb杂交带用EcoRI和HindIII酶切后，正常出现2.1、3.1、16kb杂交带；

患者出现2.1、16kb杂交带。

遗传性疾病的基因诊断和产前诊断-地中海贫血,5.6kb4.8kb4.1kb,16kb3.1kb2.1kb,（三）RFLP技术可选择的几个因素,1限制性内切酶是影响RFLP图谱的一个重要因素。

已分离500种，常见的100多种识别序列：

多数为4至6个碱基识别4个碱基对的限制性内切酶能把人基因组DNA切出较短的小片段，而识别6个或更多碱基对的限制性内切酶，酶解出的较长的DNA片段。

如Sao3AI识别GATC如EcoRI位点为GAATTC反应条件：

包括反应液的pH，内含乙醇、甘油的量，反应温度和时间等，以及DNA的质量和浓度。

星号*活性，即非特异性酶解活性,限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

识别位点：

回文序列,反转重复序列，即旋转对称结构一般为48个碱基对例如EcoRI的识别序列：

5-GAATTC-33-CTTAAG-5BamHI识别序列：

5-GGATCC-33-CCTAGG-5,2核酸探针由于人基因组DNA链很长，用某一限制性内切酶消化后，酶解出来的各种不同长度的片段往往数量巨大，电泳后几乎是连续排列的，无法进行分析比较。

选取某种特定的DNA片段作为探针，标上一定的标记物（如同位素、生物素等），利用碱基互补的两条DNA单链能结合（杂交）的原理，就可以在连续排列的一系列DNA片段中显示出与探针有同源序列的某些DNA片段。

不同的DNA探针会显示出不同类型的RFLP图谱。

探针分类：

（1）基因探针大多数取自人基因组中某一基因的一个片段。

人类基因组中，最早确定有多态性的是珠蛋白基因位点和胰岛素基因位点。

cDNA探针用mRNA反转录成cDNA，探测的是此基因中的外显子部分。

人工合成可以随研究者的设计而合成,

（2）随机探针,随意挑选出的DNA片段要能够揭示出人基因组DNA的酶切片段长度多态性就行。

能比较快地了解该染色体的某些限制性片段多态性与研究对象（如某种疾病基因）的相关性。

片段较大的随机DNA探针比片段较小的更易检测出RFLP来,（3）重复序列探针如小卫星DNA，其重复单位群集在基因组的某一特定区域。

重复序列探针能检测出基因组中多处具有此类重复序列的DNA片段。

能一次性检测出多个位点的DNA片段多态性,Jeffreys等从第22号染色体上肌红蛋白基因的内含子中分离出来的高度可变的“小卫星DNA”探针。

并证明两个无关个体之间，这类多态性相同的机会极微（只有31011），因而他称这种RFLP图谱为DNA“指纹”。

应用：

亲子鉴定法医学个人认定人类学研究遗传病相关性分析,人的DNA指纹分析示意图子女DNA指纹图中分别与其父、母的DNA指纹中相应的分子杂交条带相对应,（4）人工合成的寡核苷酸探针1986年，Ali等以AluI和MboI酶消化人基因组DNA后，用人工合成的（GATA）的寡核苷酸作探针进行检测，发现其RFLP图谱同样具有个体特异性。

这类探针检测的对象主要是人基因组中的散在重复序列DNA。

提示：

根据自己研究的主要对象来设计各种各样的探针（包括各种长度的以及各种碱基组成的）。

人基因组DNA用合适的探针和限制性内切酶酶切，一般都能揭示出人基因组中的RFLP。

1.检测对象的DNA分子必须保持大分子。

在抽提DNA过程中避免人为地将DNA分子机械性切割成小片段的DNA，否则最终的结果可能是一种假象。

2.在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则也会出假结果。

3.被消化的DNA浓度不能太