Transwell实验原理与操作步骤_精品文档Word格式文档下载.doc

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这里主要谈几种大家常用的实验：

（1）共培养体系：

小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µ

m以下孔径。

常用0.4、3.0µ

m。

我们实验室用的是0.4µ

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

（2）趋化性实验：

可用5.0、8.0、12.0µ

m膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

①细胞B对细胞A的趋化作用：

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

②趋化因子对细胞的趋化作用：

将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

（3）肿瘤细胞迁移实验：

常用8.0、12.0µ

m膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

（4）肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0µ

m膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

transwell侵袭实验，其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。

我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了，大概原理就是这样的。

第一节概念

这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1.Transwell

关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membranefilters），也可认为是一种有通透性的支架（permeablesupports）。

下图是一个Transwell装置的纵切面

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

（2）趋化性实验

（3）肿瘤细胞迁移实验

（4）肿瘤细胞侵袭实验

上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。

计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

2.肿瘤细胞侵袭模型

用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种（引自司徒镇强《细胞培养》）：

2.1体内癌细胞侵袭模型

2.1.1皮下移植侵袭模型

2.1.2肌肉内移植侵袭模型

2.1.3腹腔内移植侵袭模型

2.1.4小鼠肾包膜下移植侵袭模型

2.1.5鼠睾丸包膜下移植侵袭模型

2.1.6小鼠耳廓皮下移植侵袭模型

2.1.7鼠爪垫皮下移植侵袭模型

2.1.8视网内界膜侵袭模型

2.2体外癌细胞侵袭模型

2.2.1体外静止器官培养法

2.2.1.1半固体培养基单细胞器官培养法

2.2.1.2液体培养基单细胞器官培养法

2.2.2半体外半体内器官培养法

2.2.3单层细胞器官培养法

2.2.4瘤细胞球体器官培养法

2.2.4.1静止球体器官培养法

2.2.4.2旋转摇动球体器官培养法

2.2.5单层细胞侵袭实验模型

2.2.6Transwell侵袭小室测定法

可见，Transwell与侵袭实验之间并不能划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多种方法。

所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。

由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不能认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法。

第二节Transwell侵袭实验

我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。

1.实验用品：

①Transwell小室：

多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boydenchamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。

这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。

BD也有已包被好的，价格不清楚。

Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。

下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。

linanping1979战友提供的价格：

coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µ

m，用于肿瘤的侵袭实验。

iceyxy战友提供的价格：

Millipore的8µ

m的50个1760RMB,0.4µ

m的2000多,是一次性的。

梅林战友提供的BD价格：

240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的。

liguofan说国产的boyden30块一个。

jjyy提供的价格是：

corningcatNo.3422.6.5mmtranswellwith8.0umprorepolycarbonatemembraneinsert,Qty48,950人民币不到。

平均每个20元不到。

Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。

不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。

我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。

sword01战友提供的处理方法：

用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×

5min，蒸馏水3×

5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×

2。

因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。

以前的ChemiconECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！

很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试。

本人没见过，有兴趣的可以自己研究一下。

另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。

Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试。

maojianwen战友的使用方法：

trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公