附录8检测方法Word文档格式.docx
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4.7甲酸：
4.8无水硫酸钠。
4.91%乙酸乙腈溶液：
取冰乙酸10mL，用乙腈稀释至1000mL。
4.1050%乙腈水溶液：
取50mL乙腈，用水稀释至100mL。
4.110.1%甲酸水溶液：
取1mL甲酸，用水稀释至1000mL。
4.12金刚烷胺、D15-金刚烷胺标准贮备液：
分别精密称取10mg金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准品分别于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准贮备液，-20℃以下保存，有效期3个月。
4.13金刚烷胺、D15-金刚烷胺标准工作液：
分别精密量取1mg/mL的金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准贮备液0.1mL，分别于100mL容量瓶中用甲醇稀释至刻度，配制成金刚烷胺浓度为1µ
g/mL，D15-金刚烷胺浓度为1µ
g/mL的标准工作液，28℃保存，有效期2周。
4.14净化吸附剂：
PSA（乙二胺-Ｎ-丙基硅烷），粒度40µ
m。
5仪器和设备
5.1液相色谱－串联质谱仪且配有电喷雾离子源（ESI）。
5.2天平：
感量0.01g。
5.3分析天平：
感量0.00001g。
5.4均质机。
5.5涡旋混合器。
5.6旋转蒸发仪。
5.7离心机：
转速3000r/min。
5.8高速离心机：
转速10000r/min。
5.9氮吹仪。
5.10滤膜：
0.22µ
5.11针式过滤器：
内填有50mg的PSA净化吸附剂，滤膜孔径0.22µ
6试料的制备与保存
6.1试料的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。
取适量新鲜或冷藏的空白或供试禽蛋，去壳后混合均匀。
取匀浆后的供试样品，作为供试试料。
取匀浆后的空白样品，作为空白试料。
取匀浆后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
6.2试料的保存
-20℃以下保存。
7测定步骤
7.1提取
称取试料2.00.05g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入D15-金刚烷胺标准工作液20l。
然后加入1%乙酸乙腈溶液10mL，漩涡2min，3000r/min离心5min，上清液转入另一50mL离心管中，重复提取一次，合并两次上清液，备用。
7.2净化
备用液中加入无水硫酸钠3g，正己烷10mL，涡旋1min，3000r/min离心5min，弃去正己烷层，剩余溶液转至100mL鸡心瓶中，40℃水浴下旋转蒸干，用1.0mL甲醇溶解残渣。
（1）加入PSA50mg，涡旋30s，取上清液过滤膜至1.5mL试管中；
或者
（2）直接匀速通过针式过滤器，呈滴状流入1.5mL试管中。
量取滤液0.5mL于离心管中，40℃氮气吹干，加入50%乙腈水溶液0.5mL，涡旋30s，10000r/min离心5min，取上清液供上机测定。
7.3标准曲线的制备
溶剂标准溶液：
准确量取金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准工作液适量，用50%乙腈水溶液稀释配制成金刚烷胺浓度为2、4、10、20、100、200µ
g/L，D15-金刚烷胺浓度均为20µ
g/L的金刚烷胺系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱测定。
基质匹配标准溶液：
取空白猪肝和猪肾试料，除不加D15-金刚烷胺标准工作液外，均按上述方法处理分别制得其空白基质溶液，准确量取金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准工作液适量，分别用猪肝和猪肾的空白基质溶液稀释，配制成金刚烷胺浓度为2、4、10、20、100、200µ
g/L的系列猪肝和猪肾基质匹配标准溶液，临用现配，供液相色谱-串联质谱测定。
7.4测定
7.4.1色谱条件
色谱柱：
C18，1502.1mm，粒径3.5μm，或相当者；
流动相：
A为0.1％甲酸水溶液，B为甲醇；
流速：
0.3mL/min；
进样量：
10µ
L；
预平衡时间：
2min；
流动相梯度洗脱程序见表1：
表1梯度洗脱程序
时间（min）
A（%）
B（%）
曲线类型
90
10
1.5
维持不变
2
线性变化
5
5.1
7.4.2质谱条件
离子源：
电喷雾离子源；
扫描方式：
正离子扫描；
检测方式：
多反应离子监测（MRM）；
脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体。
喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最优灵敏度。
监测离子参数情况见表2。
表2金刚烷胺和D15-金刚烷胺特征离子参考质谱条件
化合物
定性离子对
m/z
定量离子对
去簇电压
（DP）/V
碰撞能
（CE）/eV
金刚烷胺
152.0>
135.0
50
18
93.0
48
40
D15-金刚烷胺
167.3>
150.3
35
7.4.3定性测定
通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。
试样与标准品保留时间的相对偏差不大于5%；
试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中存在金刚烷胺残留。
表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度
>
50%
20%至50%
10%至20%
≤10%
允许的相对偏差
±
20%
25%
30%
7.4.4定量测定
取试样溶液、溶剂标准溶液或基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，按内标法以峰面积比定量，标准溶液及试样溶液中金刚烷胺和D15-金刚烷胺峰面积比均应在仪器检测的线性范围内。
在上述色谱-质谱条件下，典型的金刚烷胺标准溶液、空白试样溶液和空白试样添加金刚烷胺溶液中特征离子的质量色谱图分别见附录A。
7.5空白试验
除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行测定。
8结果计算和表述
单点校准：
…………………………………
（1）
或标准曲线校准，由：
……………………………………………
（2）
求得a和b，则……………………………………………（3）
试料中金刚烷胺的残留量（μg/kg）按下式计算：
………………………………………………………（4）
式中：
X──供试试样中金刚烷胺残留量，µ
g/kg。
Ci──试样溶液中金刚烷胺浓度，µ
g/L。
Cis──试样溶液中D15-金刚烷胺浓度，µ
Cs──标准溶液中金刚烷胺浓度，µ
C'
is──标准溶液中D15-金刚烷胺浓度，µ
Ai──试样溶液中金刚烷胺峰面积。
Ais──试样溶液中D15-金刚烷胺峰面积。
As──标准溶液中金刚烷胺峰面积。
A'
is──标准溶液中D15-金刚烷胺峰面积。
V──溶解残渣的甲醇体积，mL。
m──供试试样的质量，g。
注：
计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
9检测方法的灵敏度、准确度和精密度
9.1灵敏度
本方法的检测限为1µ
g/kg，定量限为2µ
9.2准确度
本方法在2µ
g/kg～100µ
g/kg添加浓度水平上的回收率为70%～120%。
9.3精密度
本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。
附录A
（资料性附录）
（167.3>
150.3）
（152.0>
135.0）
附图A.1金刚烷胺标准溶液特征离子质量色谱图（4μg/L）
附图A.2空白猪肉试样特征离子质量色谱图
附图A.3空白猪肉添加金刚烷胺特征离子质量色谱图（2μg/kg）
附录2
动物性食品中四环素类药物残留量的测定液相色谱法
1.范围
本标准规定了动物性食品中四环素类药物残留量检测的制样和液相色谱的测定方法。
本标准适用于猪、牛、羊、鸡的肌肉、肝脏和肾脏，猪和鸡的皮+脂肪和鸡蛋、牛奶、鱼肌肉、虾肌肉中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量的检测。
2.规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
3.原理
试样中残留的四环素类药物，经EDTA·
2Na-Mcllvaine缓冲溶液提取，HLB固相萃取柱串联LCX固相萃取柱净化，高效液相色谱-紫外法测定，以外标法定量。
4.试剂与材料
4.1盐酸土霉素标准品：
含量≥97.0%；
盐酸四环素标准品：
含量≥97.5%；
盐酸金霉素标准品：
含量≥93.1%；
盐酸多西环素标准品：
含量≥98.2%。
4.2甲醇：
4.3乙腈：
4.4三氟乙酸
4.5二氯甲烷
4.6乙二胺四乙酸二钠
4.7枸橼酸
4.8磷酸氢二钠
4.9草酸
4.10硫酸
4.11钨酸钠
4.12HLB固相萃取柱：
500mg/6ml，或相当者。
4.13LCX固相萃取柱：
4.140.1mol/L柠檬酸溶液：
取柠檬酸21.01g，用水溶解并稀释至1000mL。
4.150.2mol/L磷酸氢二钠溶液：
取磷酸氢二钠71.63g，用水溶解并稀释至1000mL。
4.16Mcllvain缓冲溶液（pH＝4.0）：
取0.1mol/L枸橼酸溶液1000mL、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液625mL，混匀，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至4.0±
0.05。
4.17EDTA·
2Na-Mcllvaine缓冲溶液：
取乙二胺四乙酸二钠60.5g，加Mc
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