BDFACSCalibur流式细胞仪操作手册文档格式.docx

BDFACSCalibur流式细胞仪操作手册文档格式.docx

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SSCPMT只收488nm波长散射光

FL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围〔波长515-545nm〕

FL2PMT荧光光谱峰值落在橙红色范围〔波长564-606nm〕

FL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围〔波长>

650nm〕

3.仪器面板：

仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。

流速控制：

LO：

样品流速：

12μl/min

MED：

样品流速：

35μl/min

HI:

60μl/min

功能控制：

∙RUN：

此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。

〔正常显示绿色；

黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。

〕

∙STANDBY：

无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停顿流动，雷射功率自动降低。

∙PRIME：

去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。

PRIME完毕，仪器恢复STANDBY状态。

4.储液箱抽屉：

在主机左下方之储液箱抽屉。

可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter，及空气滤网Airfilter。

请注意气路减压阀VENTTOGGLE之位置。

∙鞘液筒：

位于抽屉左侧，容积4升。

装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约3小时。

筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。

鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。

∙废液筒：

位于抽屉右侧，容积4升。

筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。

注意废液可能有潜在的生物传染性。

∙鞘液过滤器：

0.22μm过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。

∙气路减压阀：

沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。

在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。

∙空气过滤网：

用于过滤冷却雷射的空气。

5.上样品区：

上样品区是样本管的上样位置。

它包括三个局部，一个是进样针SampleInjectionTube，将样本输入流动室，还有就是支撑架TubeSupportArm、和液滴存留系统DropletContainmentSystem。

∙进样针：

是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。

进样管外有一套管，是液滴保存系统的一局部。

∙支撑架：

用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。

支撑架有三个位置：

位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。

液滴存留系统：

系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。

当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。

上样时，须注意将支撑架位于中位，以防止过多样品被抽吸到废液筒内〔当支撑架位于中位，真空帮浦停顿工作〕。

更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；

切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。

1.2Macintosh计算机与打印机：

准备您的细胞样品

1.理想样品浓度调至1-10X105cells/ml？

一般实验只需0.5ml的样品。

2.细胞样品务必放至BDFALCON352052试管中，否那么无法上机。

3.上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞？

可使用附滤网BDFALCON试管（Cat.No.352235）或35-55μm的尼龙筛网。

4.供流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大局部样品都需经荧光染色。

外表抗原荧光染色的方法大致有两种：

直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。

研究生可至本公司网站下载染色方法

∙直接免疫荧光染色

∙Lysed-No-WashProcedure

∙Lysed-And-WashProcedure,SimulTEST&

HLA-B27

∙PeripheralBloodMononuclearCellProcedure

∙LeukemiaandLymphomaProcedure1

∙LeukemiaandLymphomaProcedure2,B-cellClonalityAssay

∙间接免疫荧光染色

∙滴定抗体浓度

∙常用试剂

5.如因特殊因素无法下载上述实验方法，请e-mail：

。

二、开机、关机标准操作

2.1FACSCalibur开机

1.开启细胞仪电源。

2.开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。

3.开启计算机。

4.确认鞘流液筒有八分满的FACSFlow，确实旋紧（鞘液筒容量为4L）。

5.将废液倒掉，并在废液筒中参加200ml家用漂白水（废液筒容量为4L）。

6.将减压阀方向调在加压〔Pressurize〕位置。

7.排除液流管路与过滤器中的气泡。

8.取下样品管，执行PRIME功能两次。

9.使用1mlPBS，HIGHRUN两分钟。

10.可开场分析样品。

2.2FACSCalibur关机

关机前必要动作：

清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。

1.将样品支持架左移，取2mlFACSClean〔10%Bleach〕上样品，让仪器的真空系统抽取约1ml的液体。

2.将样品支持架回正，按HIRUN，然后让FACSClean清洗管路10分钟。

3.按Standby，取下样品管，执行PRIME功能两次。

4.取2mldH2O，重复上述步骤1-3。

5.注意最后只留约1mldH2O在试管中。

6.按STANDBY五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪〔必要动作，以保护雷射光源。

7.倒掉废液，并回填200ml漂白水。

8.将减压阀放在「VENT漏气」位置。

将鞘流液筒充填至八分满。

9.退出软件“File〞→“Quit〞（如有对话选项，选择“Don‘tsave〞）。

确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。

10.关闭计算机。

“Special〞→“Shutdown〞。

三、上机分析流程

建议首次试机防止进展大量试验，仅需准备以下样品。

〔1〕NegativeControl〔不加任何抗体〕。

〔2〕CD3-FITC〔FL1单染〕。

〔3〕CD19-PE〔FL2单染〕。

〔4〕CD3-FITC/CD19-PE〔FL1/FL2双染〕。

3.1Calibur开机

1.先开启细胞仪本体再翻开计算机。

*秘技1：

如顺序相反，仪器和计算机之间无法建立正常通讯，无法执行“connecttocytometer〞。

解决之道，两者都关机、然后以正确方式重开。

2.向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在VENT位置〔箭头方向〕。

3.仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。

*秘技2：

将减压阀方向调在加压〔向前〕位置。

减压阀如在VENT〔箭头方向〕位置，按RUN功能键时将显示橙黄色〔表示仪器不正常，请检查是否失压〕，正常为绿色显示。

3.2开启CellQuest软件、编辑实验文件

4.在苹果菜单下点击CELLQuest启动软件。

桌面会出现一’Untitled’实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。

5.从工具板中点击散点图图示。

在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。

出现散点图对话方框。

6.在出现的散点图对话方框中点击PlotSource，选择Acquisition（收取），确认X和Y轴参数预设为FSC-H1024、SSC-H1024。

在颜色方框中点击MulticolorGating〔收取样品时，门内细胞将出现颜色〕。

点击OK。

此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。

7.说明：

散点图〔Dotplot〕，又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。

在图中，横坐标X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数，纵坐标Y轴那么通常表示荧光2或光散射强度的相对值。

仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。

第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H1024、SSC-H1024；

第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H1024、FL2-H1024。

修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之〔FSC：

细胞大小，SSC：

细胞折射率，FL1：

FITC绿色荧光，FL2：

PE橙色荧光，FL3：

PerCP红色荧光〕。

8.从屏幕上方Plots菜单中选择DotPlot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：

FL1-H1024，Y轴：

FL2-H1024。

点击OK，FL1/FL2的散点图出现。

完成后可将重制图移至原图右方。

9.在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在〔x，y〕＝〔101，101〕处，这些象限将指定阴性/阳性区域。

建立仪器和计算机之间通讯

10.从Acquire菜单中选择ConnecttoCytometer，此时会出现AcquisitionControl对话方框。

如果无法选择ConnecttoCytometer，参考秘技#1。

如果没见到AcquisitionControl对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择ShowAcquisitionControl。

仪器设置文件

注意：

实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。

仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。

仪器设定文件〔Instrumentsettings〕，含信号器高压〔Detector/Amps〕，阈值〔Threshold〕，荧光补偿〔Compensation〕等仪器条件的组合。

一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps--Threshold--Compensation。

11.检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。

出现Detectors/Amps窗口。

在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN〔线性放大〕，其它FL1-3为LOG〔对数放大〕，将其拖至空白区。

12.从Cytometer菜单中选择Threshold