1、SSC PMT 只收488 nm波长散射光FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围波长515-545 nmFL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围波长564-606 nmFL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围波长 650 nm3. 仪器面板:仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流速控制:LO: 样品流速:12 l /minMED:样品流速:35 l /minHI:60 l /min功能控制:RUN:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检查是否失压。STANDBY: 无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停顿流动,雷射功率自动
2、降低。PRIME:去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。PRIME 完毕,仪器恢复STANDBY状态。4. 储液箱抽屉:在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter,及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。鞘液筒:位于抽屉左侧,容积4升。装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器,鞘液用完时,仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣,保证鞘液筒密闭。废液筒:位于抽屉右侧,容积4升。筒上装有液面感应器,废液盛满时,仪器软件上
3、会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。鞘液过滤器:0.22m过滤器,去除鞘液中的杂质,保证进入流动室的鞘液是干净的。气路减压阀:沿箭头方向移动阀门开关,鞘液筒减压,气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时,需要减压。空气过滤网:用于过滤冷却雷射的空气。5. 上样品区:上样品区是样本管的上样位置。它包括三个局部,一个是进样针 Sample Injection Tube,将样本输入流动室,还有就是支撑架 Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。进样针:是一根不锈钢管,将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管,是液滴保存系统的一局部。支
4、撑架:用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置:位于样本管之下的中位,样本管左侧或右侧。液滴存留系统:系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时,真空帮浦就会启动,将液体从外管吸入废液筒内。上样时,须注意将支撑架位于中位,以防止过多样品被抽吸到废液筒内当支撑架位于中位,真空帮浦停顿工作。更换样品时,让仪器保持RUN的模式,使得进样针可以反冲;切换到STANDBY模式前,确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。1.2 Macintosh计算机与打印机:准备您的细胞样品1.理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/ml?一般实验只需0.5 ml的样品
5、。2.细胞样品务必放至BD FALCON 352052 试管中,否那么无法上机。3.上机前务必去除样品中之细胞团块,以防止管路堵塞?可使用附滤网BD FALCON试管 (Cat. No.352235) 或35-55 m的尼龙筛网。4.供流式分析的样品是单细胞悬浮液,而且大局部样品都需经荧光染色。外表抗原荧光染色的方法大致有两种:直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本公司网站下载染色方法 直接免疫荧光染色Lysed - No - Wash ProcedureLysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27Peripheral Blood M
6、ononuclear Cell ProcedureLeukemia and Lymphoma Procedure 1Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay间接免疫荧光染色滴定抗体浓度常用试剂5.如因特殊因素无法下载上述实验方法,请e-mail: 。二、开机、关机标准操作2.1 FACS Calibur 开机1.开启细胞仪电源。2.开启其它周边配备电源,如打印机及MO机。3.开启计算机。4.确认鞘流液筒有八分满的FACS Flow,确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。5.将废液倒掉,并在废液筒中参加200 ml 家用漂白水
7、(废液筒容量为4L)。6.将减压阀方向调在加压Pressurize位置。7.排除液流管路与过滤器中的气泡。8.取下样品管,执行 PRIME 功能两次。9.使用1ml PBS,HIGH RUN 两分钟。10.可开场分析样品。2.2 FACS Calibur 关机关机前必要动作:清洗进样管和外套管,防止进样管堵塞、或有染料残留。1.将样品支持架左移,取 2 ml FACSClean10%Bleach上样品,让仪器的真空系统抽取约 1 ml 的液体。2.将样品支持架回正,按 HI RUN,然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。3.按 Standby,取下样品管,执行 PRIME功能两次。4.
8、取 2 ml dH2O,重复上述步骤1-3。5.注意最后只留约 1 ml dH2O 在试管中。6.按 STANDBY 五分钟,使风扇冷却雷射后,关闭细胞仪必要动作,以保护雷射光源。7.倒掉废液,并回填 200 ml漂白水。8.将减压阀放在VENT 漏气位置。将鞘流液筒充填至八分满。9.退出软件“File“Quit(如有对话选项,选择“Dont save)。确认退出计算机中所有BD应用软件,所有数据数据已储存备份。10.关闭计算机。“Special“Shutdown。三、上机分析流程建议首次试机防止进展大量试验,仅需准备以下样品。1Negative Control不加任何抗体。2CD3-FITC
9、FL1 单染。3CD19-PEFL2 单染。4CD3-FITC /CD19-PEFL1/FL2 双染。3.1 Calibur 开机1. 先开启细胞仪本体再翻开计算机。 *秘技1:如顺序相反,仪器和计算机之间无法建立正常通讯,无法执行“connect to cytometer。 解决之道,两者都关机、然后以正确方式重开。2. 向前拉开储液箱抽屉,检查鞘液筒、废液筒水量,如需充填鞘液,将减压阀方向调在VENT位置箭头方向。3. 仪器会对鞘流液筒打气加压,请确认筒盖确实旋紧。 *秘技2:将减压阀方向调在加压向前位置。减压阀如在VENT箭头方向位置,按RUN功能键时将显示橙黄色表示仪器不正常,请检查是
10、否失压,正常为绿色显示。3.2开启CellQuest 软件、编辑实验文件4. 在苹果菜单下点击CELLQuest 启动软件。桌面会出现一Untitled 实验文件,可点击实验文件的右上角的放大钮,将实验文件窗口放大。5. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击,拖曳对角线至适当大小,然后放开鼠标。出现散点图对话方框。6. 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source,选择Acquisition (收取) ,确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击Multicolor Gating收取样品时,门内细胞将出现颜色。点击OK。此时实验文件会出
11、现FSC/SSC散点图。7. 说明:散点图Dotplot,又称二维散点图是流式分析最常用图谱,它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中,横坐标X轴为为荧光1强度的相对值,单位是道数,纵坐标Y轴那么通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024;第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数,并依需要选择之FSC:细胞大小,SSC:细胞折射率,FL1:FITC绿色荧光,FL2:PE橙色荧光,FL3:PerCP红色荧光。8. 从屏幕上
12、方Plots菜单中选择Dot Plot功能,可复制一个同样大小的散点图,在出现的对话方框内选择X轴:FL1-H 1024,Y轴:FL2-H 1024。点击OK,FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。9. 在工具板中选择四象限工具,在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在x,y101,101处,这些象限将指定阴性/阳性区域。建立仪器和计算机之间通讯10. 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer,此时会出现Acquisition Control 对话方框。如果无法选择Connect to Cytometer,参考秘技 #1。如果没
13、见到Acquisition Control 对话,可到屏幕上方Windows菜单中选择Show Acquisition Control。仪器设置文件注意:实验数据质量,取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改,研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件Instrument settings,含信号器高压Detector/ Amps,阈值Threshold,荧光补偿Compensation等仪器条件的组合。一般而言,仪器设定的顺序为Detector/Amps - Threshold - Compensation。11. 检查现有仪器条件,从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN线性放大,其它FL1-3为LOG对数放大,将其拖至空白区。12. 从Cytometer菜单中选择Threshold
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