浙科版生物选修1 第1部分实验1 大肠杆菌的培养和分离Word文件下载.docx
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培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离,随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。
三、细菌的培养和分离
1.细菌以分裂的方式繁殖,分裂速度很快,约20分钟分裂一次。
人们在培养细菌时,一般用接种环转移带菌的培养物。
接种时,先将接种环在明火上烧红后冷却,再操作。
2.细菌的分离
(1)划线分离法:
在液体培养基中,只要接种后培养8h,每毫升培养基中就有几亿个细菌。
可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线,在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少,因此,划线到最后,可使细菌间的距离加大。
在固体培养基培养10~20h后,可由一个细菌产生单菌落,菌落不会重叠。
如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上,在斜面上划线,则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。
这种方法也可用于分离细菌,将污染的杂菌除去。
接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么?
【提示】 取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物;
除第一次划线外,其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种;
取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行,目的是防止高温杀死菌种;
最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。
(2)涂布分离法:
先将培养的菌液稀释,通常稀释10-5~10-7倍,然后取0.1mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌落。
通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。
将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后,再做功能性实验。
细菌的两种分离法各有优点,都可采用。
划线分离法,方法简单;
涂布分离法,单菌落更易分开,但操作复杂些。
四、灭菌操作
1.各种器皿必须是无菌的:
实验用具用牛皮纸或报纸包好,所有容器都先封口,然后进行高压蒸汽灭菌(1kg/cm2压力、121℃、15min)处理,并在超净台上使用。
注意:
实验中所需棉花不能用脱脂棉,因为脱脂棉易吸水。
2.各种培养基必须是无菌的。
3.细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。
培养皿需倒置,防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基,冲散菌落。
五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤
1.在两个250mL三角瓶中分别装入50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基,加上封口膜。
将培养皿包好,连同培养基一同灭菌15min。
2.灭菌后待培养基冷却至60℃时,关闭紫外灯,点燃酒精灯,并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。
在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶,左手拿培养皿,并将培养基倒入4个培养皿中,将培养皿置于水平位置上,待其凝固。
为什么要在酒精灯火焰旁进行操作?
【提示】 酒精灯火焰旁约10cm的空间是一个无菌区,在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。
3.扩大培养
先将接种环在酒精灯火焰上烧红,再深入到大肠杆菌斜面,使环冷却后,取菌体,并将菌体放入三角瓶液体培养基中,封瓶后在37℃每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
4.划线分离
用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中,然后在固体培养基的平板上连续划线,接种环需蘸菌液1次,划线后盖好皿盖,将培养皿倒置,在37℃,恒温培养箱中培养12~24h后,可在划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分离。
5.在无菌操作下将单菌落用接种环取出,再用划线法接种在斜面上,37℃培养24h后,置于4℃冰箱中保存。
微生物培养的基本条件
1.培养基及其类型
(1)培养基:
①概念:
人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质,此即培养基。
②作用:
在提供主要营养物质的基础上,培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求,如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素,培养霉菌时需将pH调至酸性,培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。
(2)培养基的种类
划分标准
培养基种类
特点
用途
物理性质
液体培养基
不加凝固剂
微生物的扩大培养、工业生产
半固体培养基
加凝固剂,如琼脂
观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
选择培养基
培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌,可在培养基中加入青霉素;
培养金黄色葡萄球菌,可在培养基中加入高浓度食盐)
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物,如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有,菌落呈深紫色,并带有金属光泽)
2.无菌技术
进行微生物培养获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染,无菌技术即围绕着如何避免杂菌的污染展开,主要包括以下几个方面:
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
3.消毒和灭菌的比较
概念
常用方法
应用的范围
消毒
使用较为温和的物理或化学方法,杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法:
在100℃开水中煮沸5~6min
一般物品
巴氏消毒法:
70~75℃煮30min或在80℃煮15min
对于一些不耐高温的液体,如牛奶
化学药剂消毒法
如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等
灭菌
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)
灼烧灭菌:
酒精灯火焰
接种工具的灭菌
干热灭菌:
干热灭菌箱内160~170℃下灭菌1~2h
玻璃器皿、金属工具的灭菌
高压蒸汽灭菌:
121℃条件下,灭菌15~30min
培养基及容器的灭菌
注:
消毒与灭菌的最大区别是芽孢和孢子能否存活
某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。
实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。
请回答与此实验相关的问题。
(1)制备培养基:
根据物理性质的不同,可以将培养基分为液体、半固体和固体培养基。
对细菌进行大量的扩增,用________培养基进行培养;
对细菌进行分离,用________培养基进行培养。
(2)灭菌:
在培养微生物时必须进行无菌操作,包括各种________都必须是无菌的。
对它们进行灭菌,通常用________法灭菌。
(3)接种及培养:
接种时常用的工具是________和玻璃三角刮刀。
为了尽快观察到细菌培养的实验结果,应将接种了湖水样品的平板置于________中培养,培养的温度设定在37℃。
要使该实验所得结果可靠,还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。
(4)菌落观察计数:
培养20小时后,观察到平板上有形态和颜色不同的菌落,这说明湖水样品中有________种细菌。
一般说来,菌落总数越多,湖水遭受细菌污染的程度越________。
(5)选择培养基是在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。
如果提高培养基中NaCl的浓度,可以用于筛选耐________细菌。
【思路点拨】
(1)细菌扩大培养用液体培养基,分离用固体培养基。
(2)无菌操作包括所有的器皿要无菌,所有的培养基要无菌,接种过程要防止杂菌污染。
实验室中常用高压蒸汽灭菌法。
(3)接种时常用接种环,用恒温培养箱保持温度。
在实验过程中,除实验变量以外的其他各变量应适宜且相同,以利于更好地实现实验目的。
(4)不同的菌落具有各自不同的菌落特征(如硬度、颜色、透明度、光滑度等。
)(5)选择培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
【答案】
(1)液体 固体平面
(2)器皿和培养基高压蒸汽灭菌 (3)接种环 恒温培养箱 无菌水(4)多 高 (5)盐(或NaCl)
1.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦试、火焰灼烧等几种不同的处理,这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )
A.接种环、手、培养基B.高压锅、手、接种环
C.培养基、手、接种环D.接种环、手、高压锅
【解析】 此题考查对无菌技术的掌握。
高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备,通常用于培养基的灭菌。
用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。
火焰灼烧,可以迅速彻底地灭菌,适用于微生物接种工具的灭菌,如接种环。
【答案】 C
大肠杆菌的培养和分离
1.LB培养基的制备
(1)计算:
根据LB培养基配方的比例,计算配制50mL的培养基时各种成分的用量。
(2)称量:
准确地称取各种成分。
即:
蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g,加水50mL。
(如配LB固体培养基,则再加1g琼脂)
(3)制备空白斜面:
将LB液体培养基配好,加入琼脂并加热使之融化后,通过玻璃漏斗加入试管中,每试管2mL,加棉塞并将试管捆在一起,上端加盖一张牛皮纸,灭菌。
灭菌后斜靠于平放的铅笔上,冷却后即成空白斜面培养基。
2.进行大肠杆菌培养与分离操作
(1)灭菌
(2)制备LB固体平面培养基——倒平板操作
待培养基冷却至60℃左右时,在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板的具体操作描述如下:
(3)扩大培养
①左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶,右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。
②将接种环在火焰上烧红,再深入到斜面,使其冷却后取菌体。
③将菌体放入三角瓶液体培养基中(将封口膜及斜面棉塞复原)。
④三角瓶在37℃摇床振荡培养12h。
(4)划线分离
①取种
在酒精灯火焰上灼烧接种环,将上述培养后的菌液打开,接种环部分深入到菌液中取种。
②平板划线操作
在LB固体培养基的平板上连续划线(如下图所示),划线后盖好培养皿。
③培养
将上述划线操作后的培养皿倒置放至37℃恒温培养箱中培养12~24h,可看到划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分离。
(5)菌种纯化与保藏
在无菌操作下,将单菌落用接种环取出,再用划线法接种至斜面上,37℃培养24h后,4℃冰箱保存即可。
划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面,以期在连续划线后,可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体(菌落),从而达到纯化菌种的目的,为此,在划线操作时,接种环只需在菌液中蘸取菌液一次,且作第二次及其以后的划线操作时,须从上一次划线的末端划线——如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少,并逐步分散,最终实现在平板上得