浙科版生物选修1 第1部分实验1 大肠杆菌的培养和分离.docx

浙科版生物选修1 第1部分实验1 大肠杆菌的培养和分离.docx

《浙科版生物选修1 第1部分实验1 大肠杆菌的培养和分离.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浙科版生物选修1 第1部分实验1 大肠杆菌的培养和分离.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

浙科版生物选修1第1部分实验1大肠杆菌的培养和分离

实验1大肠杆菌的培养和分离

课　标　解　读

重　点　难　点

1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。

2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。

3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。

1.微生物实验的无菌操作。

2.利用LB液体培养基进行细菌培养。

3.利用LB固体培养基分离大肠杆菌。

4.划线分离法和涂布分离法。

一、大肠杆菌

1．大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。

2．在肠道中，大肠杆菌一般对人无害，但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。

3．大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。

二、实验内容

1．本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。

分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。

2．本实验用LB液体培养基（通用的细菌培养基）扩大培养大肠杆菌。

培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。

三、细菌的培养和分离

1．细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。

人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。

接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。

2．细菌的分离

（1）划线分离法：

在液体培养基中，只要接种后培养8h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。

可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。

在固体培养基培养10～20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。

如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。

这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。

接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么？

【提示】　取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

（2）涂布分离法：

先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。

通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。

将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。

细菌的两种分离法各有优点，都可采用。

划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。

四、灭菌操作

1．各种器皿必须是无菌的：

实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌（1kg/cm2压力、121℃、15min）处理，并在超净台上使用。

注意：

实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。

2．各种培养基必须是无菌的。

3．细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。

注意：

培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。

五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤

1．在两个250mL三角瓶中分别装入50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基，加上封口膜。

将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15min。

2．灭菌后待培养基冷却至60℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。

在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。

为什么要在酒精灯火焰旁进行操作？

【提示】　酒精灯火焰旁约10cm的空间是一个无菌区，在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。

3．扩大培养

先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37℃每分钟200转的摇床上振荡培养12h。

4．划线分离

用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37℃，恒温培养箱中培养12～24h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。

5.在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存。

微生物培养的基本条件

1.培养基及其类型

（1）培养基：

①概念：

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，此即培养基。

②作用：

在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求，如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将pH调至酸性，培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。

（2）培养基的种类

划分标准

培养基种类

特点

用途

物理性质

液体培养基

不加凝固剂

微生物的扩大培养、工业生产

半固体培养基

加凝固剂，如琼脂

观察微生物的运动、分类鉴定

固体培养基

微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种

用途

选择培养基

培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长

培养、分离出特定微生物（如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐）

用途

鉴别培养基

根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品

鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽）

2.无菌技术

进行微生物培养获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术即围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：

（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

3．消毒和灭菌的比较

概念

常用方法

应用的范围

消毒

使用较为温和的物理或化学方法，杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）

煮沸消毒法：

在100℃开水中煮沸5～6min

一般物品

巴氏消毒法：

70～75℃煮30min或在80℃煮15min

对于一些不耐高温的液体，如牛奶

化学药剂消毒法

如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等

灭菌

使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）

灼烧灭菌：

酒精灯火焰

接种工具的灭菌

干热灭菌：

干热灭菌箱内160～170℃下灭菌1～2h

玻璃器皿、金属工具的灭菌

高压蒸汽灭菌：

121℃条件下，灭菌15～30min

培养基及容器的灭菌

注：

消毒与灭菌的最大区别是芽孢和孢子能否存活

　某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。

实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。

请回答与此实验相关的问题。

（1）制备培养基：

根据物理性质的不同，可以将培养基分为液体、半固体和固体培养基。

对细菌进行大量的扩增，用________培养基进行培养；对细菌进行分离，用________培养基进行培养。

（2）灭菌：

在培养微生物时必须进行无菌操作，包括各种________都必须是无菌的。

对它们进行灭菌，通常用________法灭菌。

（3）接种及培养：

接种时常用的工具是________和玻璃三角刮刀。

为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37℃。

要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。

（4）菌落观察计数：

培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。

一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。

（5）选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。

如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐________细菌。

【思路点拨】　

（1）细菌扩大培养用液体培养基，分离用固体培养基。

（2）无菌操作包括所有的器皿要无菌，所有的培养基要无菌，接种过程要防止杂菌污染。

实验室中常用高压蒸汽灭菌法。

（3）接种时常用接种环，用恒温培养箱保持温度。

在实验过程中，除实验变量以外的其他各变量应适宜且相同，以利于更好地实现实验目的。

（4）不同的菌落具有各自不同的菌落特征（如硬度、颜色、透明度、光滑度等。

）（5）选择培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。

【答案】　

（1）液体　固体平面　

（2）器皿和培养基高压蒸汽灭菌　（3）接种环　恒温培养箱　无菌水（4）多　高　（5）盐（或NaCl）

1．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦试、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌（　　）

A．接种环、手、培养基B．高压锅、手、接种环

C．培养基、手、接种环D．接种环、手、高压锅

【解析】　此题考查对无菌技术的掌握。

高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。

用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。

火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种环。

【答案】　C

大肠杆菌的培养和分离

1.LB培养基的制备

（1）计算：

根据LB培养基配方的比例，计算配制50mL的培养基时各种成分的用量。

（2）称量：

准确地称取各种成分。

即：

蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g，加水50mL。

（如配LB固体培养基，则再加1g琼脂）

（3）制备空白斜面：

将LB液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管2mL，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸，灭菌。

灭菌后斜靠于平放的铅笔上，冷却后即成空白斜面培养基。

2．进行大肠杆菌培养与分离操作

（1）灭菌

（2）制备LB固体平面培养基——倒平板操作

待培养基冷却至60℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。

倒平板的具体操作描述如下：

（3）扩大培养

①左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶，右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。

②将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使其冷却后取菌体。

③将菌体放入三角瓶液体培养基中（将封口膜及斜面棉塞复原）。

④三角瓶在37℃摇床振荡培养12h。

（4）划线分离

①取种

在酒精灯火焰上灼烧接种环，将上述培养后的菌液打开，接种环部分深入到菌液中取种。

②平板划线操作

在LB固体培养基的平板上连续划线（如下图所示），划线后盖好培养皿。

③培养

将上述划线操作后的培养皿倒置放至37℃恒温培养箱中培养12～24h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。

（5）菌种纯化与保藏

在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，再用划线法接种至斜面上，37℃培养24h后，4℃冰箱保存即可。

划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，以期在连续划线后，可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体（菌落），从而达到纯化菌种的目的，为此，在划线操作时，接种环只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的划线操作时，须从上一次划线的末端划线——如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散，最终实现在平板上得