微生物实验Word文档下载推荐.docx

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数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；

分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。

式中λ=光波波长

由上述可知若n值和α角越大则N·

A越大或光波波长越短，则显微镜的分辨力越大（图Ⅰ-2）。

一些物质的折射率：

水1.33玻璃1.52空气1.0香柏油1.515。

二、实验器材

1、 

仪器显微镜；

2、 

材料香柏油，二甲苯，擦镜纸。

三、操作步骤

显微镜构造见图Ⅰ-3

图Ⅰ-3光学显微镜的构造

1.物镜转换器2.接物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.彩虹光阑7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺旋12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋

1、取镜

显微镜是光学精密仪器，使用时应特别小心。

从镜箱中取出时，一手握镜臂，一手托镜座，放在实验台上。

在使用时要特别小心。

使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否完全合用，镜身有无尘土，镜头是否清洁。

做好必要的清洁和调整工作。

2、调节光源

1）将低倍物镜旋到镜筒下方，旋转粗调螺旋，使镜头和载物台距离约为0.5厘米左右。

2）上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。

3）左眼看目镜调节反光镜镜面角度（在天然的光线下观察，一般用平面反光镜；

若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜）。

开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。

一般染色标本油镜检查对，光度宜强，可将光圈开大，聚光器上升到最高，反光镜调至最强；

未染色标本，在低倍镜或高倍镜观察时，应适当地缩小光圈，下降聚光器，调节反光镜，使光度减弱，否则光线过强不易观察。

3、低倍镜观察

低倍物镜（8⨯或10⨯）视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。

操作步骤：

1）先将标本玻片置于载物台上（注意标本朝上），并将标本部位处于物镜的正下方、转动粗调螺旋，上升载物台使物镜至距标本约0.5厘米处。

2）左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节螺旋使载物台缓慢上升，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部位。

3）移动推动器。

将所要观察的部位置于视野中心，准备换高倍镜观察。

4、高倍镜观察将高倍物镜（40⨯）转至镜筒下方（在转换物镜时，要从侧面注视。

以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞），调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。

5、油镜观察

1）用粗调螺旋提起镜筒，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。

在标本镜检部位滴上一滴香柏油。

右手顺时针方向慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并及时从侧面注视使油浸物镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止（注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头）。

2）左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下降载物台（注意：

此时只准下降载物台，不能向上调动），当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。

3）如果向上转动粗调螺旋已使镜头离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。

4）观察完毕，下降载物台，取下标本片。

先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。

切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。

5）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。

罩上镜套，然后放回镜箱中。

四、注意事项

1、显微镜镜头的保护和保养。

2、使用显微镜时应根据不同的物镜而调节光线。

实验二细菌的形态结构观察

一、实验目的与要求

观察细菌、放线菌的个体形态，学会绘制微生物的形态结构图。

二、实验材料和用具

大肠杆菌、葡萄球菌。

香柏油、二甲苯、无菌水；

显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸水纸、小滴管。

1、观察细菌的基本形态

用低倍镜、高倍镜和油镜观察大肠杆菌、葡萄球菌。

2、观察细菌的细胞结构

用低倍镜、高倍镜和油镜观察装片的细胞壁、细胞膜、细胞质、液泡等细胞结构并分别在油镜下绘图。

3、观察大肠杆菌、葡萄球菌活菌，常用压滴法观察。

（1）将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。

（2）将酒精灯放于自己正前方，点燃。

（3）用无菌操作方法从大肠杆菌或葡萄球菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。

（4）用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。

如菌液过多，可用吸水纸适当吸去一部分。

（5）先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗些。

四、注意事项1、注意擦镜头时，只能用擦镜纸。

2、观察完毕，必须将镜筒上升，才能取下装片，放入另一装片后，要按使用油镜要求，重新操作，不能在油镜下直接取下和替换装片，切记！

3、无菌操作过程中，接种环灭菌后不能触及其他物品，挑菌不能过多。

五、实验报告l、绘图你所观察到的细菌细胞结构视野图，并注明各部分。

实验三微生物细胞大小与数量的测定

一、实验目的与要求：

（1）了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。

（2）学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、物镜测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。

（3）了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算。

二、实验原理

1.微生物大小测定原理

微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。

由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。

用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺（图20-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。

测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中间像重叠）来测量经显微镜放大后的细胞物象。

由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

镜台测微尺（图20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。

校正时，将镜台测微尺放在载物台上，

图20-1目镜测微尺

由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。

2.血球计数板测定微生物数量的原理

镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。

菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；

一般细菌则采用彼得罗夫·

霍泽（PetroffHausser）细菌计数板。

两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。

而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网（图Ⅳ-2）。

每个方格网共分9大格，其中间的一大格（又称为计数室）常被用作微生物的计数。

计数室的刻度有两种：

一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；

另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成（图5）。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。

使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

图Ⅳ-2血球计数扳的构造

a.平面图（中间平台分为两半，各刻有一个方格网）

b.侧面图（中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙）

图Ⅳ-3血球计数板计数网的分区和分格

三、实验器材

1、仪器显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板、盖玻片（22mm×

22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸

2、材料酵母菌液

四、实验方法

1．目镜测微尺的校正 

把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。

先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图20-3），计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。

因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。

例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×

10μm/5＝10μm

用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。

2．细胞大小的测定

（1）将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2）

（2）取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。

（3）移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。

测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。

一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。

而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。

3.细菌数量的测定

（1）取洁净的血球计数板一