第五章阻抗蛋白质非特异性吸附载体微球的制备Word文件下载.docx

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在目前采用的阻抗蛋白质非特异性吸附的材料中，其中PEG因其特殊的亲水性、链柔顺性和无毒等特性，被广泛用于制备阻抗蛋白质吸附材料[136,148,149]。

研究认为空间位阻效应是长链PEG阻抗蛋白质非特异性蛋白吸附的重要原因;

水化作用是短链的PEG基团阻抗蛋白质非特异性吸附的重要原因[144,145,297]。

PEG阻抗蛋白质非特异性吸附的效果与PEG链的分子量、链长度、链组成和链的接枝密度等有关[297-299]。

PEG阻抗蛋白质吸附材料的制备方法可以分为物理吸附或共混、化学接枝法,更高层次为制备响应性聚合物和图案化聚合物[136,300]。

物理方法得到的PEG分子链因其与基体材料之间的作用力弱而容易脱落，面临着时效性差和吸附性能差等问题。

一般改性方法是在PEG分子链末端引入巯基，或者增加其它的作用力[163]。

化学接枝法一共有表面接枝（Graftfrom）和接枝到表面（Graftto）两种方法[150]。

两种方法制备的PEG阻抗材料能满足不同的要求。

如Brooks等人[299]通过表面引发的原子转移自由基聚合法（atomtransportationradicalpolymerization，ATRP）制备了不同分子量的PEG衍生物，并接枝在聚苯乙烯的粒子上。

作者发现接枝密度随着PEG分子量的增大而降低，而PEG悬挂端基的尺寸对聚合物刷的水力学厚度有重要影响。

通过ATRP法制备的PEG材料具有很好的阻抗性，随着接枝密度的增大，蛋白质吸附降低。

在本文中，我们通过烯丙基聚乙二醇（APEG）与苯乙烯分散共聚制备阻抗蛋白质非特异性吸附的微球。

本文的目的包括：

（1）制备阻抗蛋白质非特异性吸附的单分散性微球；

（2）探讨所制备微球阻抗蛋白质非特异性的性能。

5.1实验部分

5.1.1试剂与仪器

苯乙烯，化学纯（≥98%），购于广东汕头西陇化工厂。

使用前，须将苯乙烯先用5％（wt）的NaOH水溶液洗涤、萃取，以完全脱除阻聚剂，然后减压蒸馏，最后将净化后的苯乙烯密封保存于4℃的冰箱中；

2，2′-偶氮二异丁腈（AIBN），分析纯（≥99%），购于天津科密欧化学试剂开发中心；

聚乙烯吡咯烷酮（PVP），分析纯，平均分子量约30000，购于成都科龙化工试剂厂；

无水乙醇，分析纯（≥99.7%），购于广东光华化学厂。

AIBN、PVP和无水乙醇分别用作自由基引发剂、稳定剂和分散介质。

烯丙基聚乙二醇（APEG，分子量为2400）购于华威锐科化工有限公司。

牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin,BSA，第五组分），美国Amresco公司产品。

所需的仪器包括：

SencoS-212型恒速搅拌器

上海申顺生物科技有限公司

W201恒温水浴锅

85-2型恒温磁力搅拌器

上海司乐仪器厂

AnkeTDL-40B型离心机

上海安亭科学仪器厂

WS70-1型红外线快速干燥器

上海吴淞五金厂

DZF6050真空干燥箱

上海精宏实验设备有限公司

HZS-H水浴振荡器

哈尔滨市东明医疗仪器公司

BS124S型万分位电子天平

德国，Sartorious公司

Leitz-AMR-1000SEM

德国，LEITZ公司

粒径及zeta电位测定仪（Zetasizer®

-HS）

英国，马尔文公司

5.2.2APEG与苯乙烯分散共聚

Fig.5-1SchematicdiagramofthepreparedAPEGfunctionalmicrospheresbyAPEGandStdispersioncopolymerization

PSt-APEG微球采用间歇式分散聚合法来制备（Fig.5-1）。

首先，将60mL乙醇、0.2gAIBN、0.4gPVP和14g苯乙烯同时加入100mL四口玻璃圆底烧瓶，并使烧瓶浸入恒温水浴中。

在250rpm的恒速搅拌下，体系中通入N2（约30min），然后升温至70℃，反应5h。

之后将0.5gAPEG溶解于15mL乙醇/水体系中，恒速滴加至烧瓶中，并将搅拌速度调整为300rpm。

APEG滴加控制在2-4h内，聚合反应总时间为12h。

反应结束后，将制备的微球先用医用纱布粗过滤，再用乙醇和三重水分别对微球进行洗涤、离心、重分散2-3次。

最后把分散好的微球置于60℃的干燥箱中干燥24h。

5.2.3无稳定剂的APEG与苯乙烯的分散共聚

将60mL乙醇、0.2gAIBN、0.5gAPEG和14g苯乙烯同时加入100mL四口玻璃圆底烧瓶，并使烧瓶浸入恒温水浴中。

在250rpm的恒速搅拌下，体系中通入N2（约30min），然后升温至70℃，反应12h。

5.2.4粒径及粒径分布测试

取小量待测微球，分散在磷酸缓冲溶液中（pH8.0，0.1M），保持相同的浓度（2mg/mL），在Nano-ZS纳米粒度与电位分析仪上测定粒径及分布情况。

5.2.5SEM

将样品在真空干燥箱中充分干燥，喷金，采用Leitz-AMR-1000的扫描电镜（SEM）观察微球表观形貌。

5.2.6蛋白质吸附

BSA在微球上的吸附实验是在25℃的恒温水浴中进行的。

首先在数只干净的塑料管中分别移入封闭处理后的微球悬浮液（微球含量为50mg）、不同量的BSA（0.36－3.96g）溶液，然后用磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.1M，pH7.0）将溶液体积调整到5.0mL。

在每个试管中加入磁力转子，对样品溶液进行温和地磁力搅拌，微球在25℃的环境温度中与BSA共同孵化8.0h。

之后，对不同离心试管中的溶液进行离心分离，收集上清液，并用2mL的缓冲溶液再对固相微球洗涤、离心、分离、再分散，重复上述步骤2次。

最后收集所有的上清液，并对上清液中BSA的浓度用紫外吸光度法进行测定。

微球对BSA的固载量可根据BSA的质量平衡来计算。

5.3结果与讨论

5.3.1APEG与苯乙烯分散共聚

5.3.1.1APEG含量

在稳定剂、引发剂浓度和乙醇/水比例相同的情况，考察了功能单体APEG含量对微球性质的影响，结果如Fig.5-2和Fig.5-3。

Fig.5-2给出了制备的微球的SEM图片，Fig.5-3是DLS测试微球的粒径和粒径分布。

从Fig.5-2可以知道，调整APEG的加入量，所制备微球的单分散性并不太好。

但从图片中也可以看出，制备的微球基本上还是呈现球形，没有缺陷，表面很光滑。

增大APEG的加入量，出现了更多的小粒子，将使微球的单分散性更差。

APEG加入量为0.2g时，开始出现了小的粒子，但是其数目不太多；

而随着APEG加入量的增加，出现了越来越多的小粒子。

出现这种现象的原因可能与APEG自身聚合到一定分子量也能起到稳定剂的作用，干扰了PVP的稳定剂作用有关。

其次，可能APEG自身能形成微球，所以APEG加入量越大，小颗粒就越多。

此外，APEG加入量越大，对初始反应体系的极性改变就越大，导致粒径分布更宽。

类似的结果也见诸报道[301]。

Fig.5-3则说明随着APEG加入量的增加，微球的粒径开始增加，在0.8gAPEG的加入量时达到最大，为4.85μm。

而粒径分布数据说明，大部分的情况下，其粒径分布测试数据都小于0.3，只有加入APEG的量为0.8g时，其粒径分布为0.41。

根据Fig.5-2和Fig.5-3综合考虑，APEG加入量最佳为0.4g，此时制备的微球单分散性较好。

对比两种方法测定的粒径和粒径分布，可知两种方法测定的结果出现了一定程度的偏差。

DLS测定的粒径分布明显好于SEM测定的情况，而且DLS测定的粒径也要大于SEM测定的粒径。

这是因为DLS测定的是粒子在溶液中的状态，而SEM测定时粒子是干燥的状态。

在溶液中，微球表面的一些分子链会呈现伸展状态，而且微球会呈现溶胀，所以测出的粒径会相对偏大一些。

另外，在溶液中，粒子会出现团聚，特别是小粒子会吸附或沉积在大的粒子上，所以DLS测定的粒径也会偏大。

此外，在大粒子的作用下，DLS可能也难以测定出小的粒子。

这也是DLS测定的粒径分布比SEM表现出的粒径分布要好一些，同时也会出现偏离真实的粒径分布。

Fig.5-2theSEMofAPEGfunctionalmicrospheres:

theamountofAPEGinpolymerizationisfrom0.2,0.4,0.6,0.8,1.2to1.6forAPEG-1,APEG-2,APEG-3,APEG-4,APEG-5andAPEG-6,respectively.

Fig.5-3theeffectofaddedAPEGamountontheaverageparticlesizeandthesizedistribution.

5.3.1.2分级离心

在上节中我们发现，采用分散聚合法制备APEG与苯乙烯共聚微球时，得到的粒子单分散性很差，并且出现了很多颗粒很小的粒子。

为了分离这些颗粒不均一的粒子，我们试图采用分级离心的方法对制备的微球进行分离。

在苯乙烯聚合不同时间（1h、2h、3h、4h和6h）后，再加入0.4gAPEG功能材料，制备了一系列的微球。

对制备的微球，先在1800rpm条件下离心10分钟，收集上层悬浮液；

再以3800rpm离心10分钟，分别测定离心后的微球的粒径及粒径分布。

Fig.5-4就是采用分级离心后的测试结果。

从Fig.5-4中可知，在苯乙烯聚合不同的时间后再加入APEG，用1800rpm速度进行离心，得到的粒子粒径逐渐减少，且粒径基本在3-4μm之间。

对于3800rpm速度离心的粒子粒径则没有规律。

两种离心速度离心的微球，其粒径分布的数值基本在0.3以下，这似乎表面分级离心可以提高制备微球的单分散性。

然而，制备微球的SEM照片说明并未得到单分散性很好的粒子（图片并未给出）。

其原因可能与微球容易粘附，易团聚，难以有效分离有关。

Fig.5-4TherelationshipofAPEGaddedtimeduringpolymerizationandthesizeandsizadistributionofobtainedmicrospheres,withcentrifugationspeedsof1800rpm（a）and3800rpm（b），respective