生物化学实验指导汇编Word文档下载推荐.docx
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掌握最常用的蛋白质制备、分离和纯化过程和方法；
通过淀粉酶的提取，活性测定以及淀粉酶动力学分析实验，加深对酶的特性认识；
进一步熟悉掌握微量滴定法的基本操作技术；
注重培养学生综合能力，通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作，掌握氨基酸含量的测定方法；
掌握核酸的提取过程以及核酸含量和纯度的测定技术；
熟悉掌握电泳技术的基本原理和操作技术；
血糖的定量测定和脂肪酸的β－氧化实验，掌握有关物质代谢中生理生化指标的测定方法；
在生化大实验中开设了《总RNA的提取及鉴定》和《半定量RT-PCR检测基因的表达差异》两个综合性大实验；
本实验模块还开设了为期6周的选修开放项目《基因的克隆、鉴定及生物信息学分析》（创新实验），使学生更好的将基础知识与专业技术衔接。
通过该实验课的基本训练，使学生掌握常见生物化学及分子生物学技术的原理和方法，提高学生独立思考、观察、分析问题和解决问题的能力，同时培养学生的创新意识、科学素养和科研能力。
通过实验，巩固和加深生物化学课程的基础理论知识，为今后的科学研究打下坚实的生物化学基础。
编者于湖南文理学院
2004年12月
目录
第一篇常用生物化学实验技术及原理
第一章透析…………………………………………………
（1）
一、膜……………………………………………………………………
（1）
二、溶剂……………………………………………………………………
（1）
三、物理条件………………………………………………………………
（2）
四、Donnan平衡…………………………………………………………
（2）
第二章层析法…………………………………………………（3）
一、柱层析法的一般技术……………………………………………………（3）
二、几种常见的层析法……………………………………………………（5）
第三章电泳技术……………………………………………（18）
一、电泳技术的基本原理……………………………………………………（19）
二、纸电泳…………………………………………………………………（21）
三、醋酸纤维薄膜电泳………………………………………………………（22）
四、琼脂糖凝胶电泳………………………………………………………（22）
五、聚丙烯酰胺凝胶电泳…………………………………………………（23）
第二篇学生实验
实验一蛋白质的性质实验…………………………………（30）
实验二牛乳中蛋白质的提取与鉴定…………………………（35）
实验三氨基酸的分离鉴定——纸层析法……………………（37）
实验四酶的特性………………………………………………（39）
实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定……………………（46）
实验六紫外分光光度法测定核酸的含量……………………（49）
实验七 维生素C的定量测定…………………………………（51）
实验八血糖的定量测定——GOD-PAP法………………………（54）
实验九 脂肪酸的β－氧化……………………………………（57）
实验十DNA的琼脂糖凝胶电泳………………………………（60）
实验十一蛋白质的透析………………………………………（62）
实验十二聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳——血清蛋白的分离……（64）
实验十三总RNA的提取及鉴定………………………………（69）
实验十四半定量RT-PCR检测基因的表达差异………………（76）
实验十五基因的克隆、鉴定及生物信息学分析………………（82）
第一章透析
透析是利用小分子能通过,而大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。
通常的做法是将小分子和大分子的混合物放进用半透膜制成的透析袋里并沉没在大量的水中。
袋内的小分子就不断通过膜进入外部溶剂中待达到平衡为止。
如果对流水透析或不断更换透析袋的溶剂可以做到袋内的混合物几乎不含小分子。
透析的速度受一些因素的影响。
下面就粗略地讨论这些因素。
一、膜
1、材料火棉胶是最常用的透析袋材料。
各种规格的火棉胶袋已做成商品出售。
也可用玻璃纸代替火棉胶。
2、制备先将一适当大小和长度的透析管放在碱性EDTA溶液中沸腾30分钟以避免待透析的分子损失活性。
然后，用蒸馏水洗涤透析管。
结扎管的一端并将所研究的材料充满透析管（袋），然后结扎顶部。
透析最好在新制备的管中进行，因为湿的透析袋非常容易受微生物感染。
如果必须保存透析袋，则应有溶液中加入痕量的苯甲酸。
3、通透性透析袋的通透性因袋的大小和预处理的方法不同而异。
但透析过夜时，半透膜大体可以允许相对分子质量（Mr）30000以下的化合物通过。
实际上没有严格的界限，透析时间延长时稍大的分子也透过膜。
有一系列的商品材料有更高的透析速度和更精细的通透范围可做精细分离之用。
二、溶剂
1、水溶液一般说，透析的速度在蒸馏水中最大，虽然通常需要特定的pH和离子强度的水溶液来稳定所研究的分子。
2、大分子溶液透析时水将进入透析袋，因此应该将透析袋装满以避免透析的材料过于稀释。
如果用一种不活泼的高分子化合物如聚乙烯醇6000代替通常使用的水溶液作为溶剂，则透析时水就会由透析袋中渗出，用这种方法透析过夜，可将200mL溶液浓缩至几mL。
三、物理条件
1、温度透析速度也受温度的影响，温度越高透析速度越快。
提高温度时，溶剂的粘度降低而扩散速度增加。
此外，许多大分子对温度很敏感，因此蛋白质等的透析通常在低温条件下进行。
2、压力大分子和小分子的分离也受通过膜时的压力梯度影响。
可将透析袋放在真空中（而不放在溶液中），并敞开透析袋的一端，此时水和小分子会渗出透析袋形成超滤液，而留在透析袋中的大分子被浓缩。
这个过程称为超滤。
四、董南（Donnan）膜平衡
由于大分子电解质的存在，而使一般电解质不均等分配在半透膜两侧的平均状态，称为膜的平衡。
蛋白质溶液的渗透压与溶液的pH有关系。
有酸性pH下，蛋白质以阳离子存在，带有正电荷；
而在碱性pH下，以阴离子存在，带有负电荷。
当蛋白质盐溶液透析时，带电的蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中对立的阴离子或阳离子就要通过半透膜以平衡电荷，这就导致离子的膜两边不均等的分布，同时关系到pH的变化。
这种现象有就称为董南效应，又称分布，同时产生pH的变化。
这种现象就称为董南效应，又称董南平衡。
如带负电荷的蛋白质盐溶液对水透析时，蛋白质不能透过透析袋，而它的反离子可以通过，结果造成环境介质中阳离子过多。
为了保持中性，水就分解出氢离子移进透析袋内，蛋白质部分的pH因此下降而水部分的pH上升。
反之，如蛋白质带正电荷，则pH的变化相反。
董南效应可以导致蛋白质沉淀或变性，因而是不可取的。
为减少董南效应，透析通常对具有适当浓度的盐溶液进行。
第二章层析法
层析法也称色谱法，是一种物理的分离方法。
它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。
层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有许多种类，可以根据所用两个相的状态和操作方式不同进行分类如表3-1。
表2-1层析法的一般分类
固定相
流动相
操作方式
名称
固体：
吸咐剂
离子交换剂
固体
液体
气体
柱型
薄层
柱层
纸
吸附层析
离子交换层析
吸附薄层层析
分配层析
分配薄层层析
纸层析
气体吸咐层析
气体分配层析
此外，还有凝胶层析、亲和层析和高压液相层析等方法。
在讨论几种常用的层析法之前，先介绍一下柱层析法的一般技术。
一、柱层析法的一般技术
1、柱层析柱通常是玻璃的。
总的说来，长柱分辨力好，但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。
2、层析材料的准备许多材料都可在层析法中使用。
在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。
例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到需的电离形式。
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低
3、装柱层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。
让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。
用溶液彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。
最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。
4、加样上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。
将样品仔细加到层析床的表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。
5、洗脱下一步是用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。
在取代扩展法中，溶剂与层析材料的相互作用比柱上的物质与层析材料的相互作用要强，于是与柱结合的分子被取代。
每一个柱能结合多少物质都有一个限度（即总柱容量）。
在取代扩展的情况下，当样品上柱量差不多达到总柱容量的50%时，一般尚能完全完分离。
但是为了得到更好的分辨力，洗脱法更为可取。
洗脱法是最常用的方法。
使用洗脱法，上柱量不超过总柱容量的10%，溶剂与柱相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。
在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。
在一个组分被洗脱后可以更换洗脱液，这就是所谓的分步洗脱。
另外，还有一个可行的方法是逐渐改充溶剂的性质，形成一个离子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱，这种方法称梯度洗脱，它的优点之一是能够减少拖尾现象。
6、部分收集及分析柱的流出液可以用人工的方法收收集到一系列试管中或使用部人收集器。
这种装置能使每一管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。
洗脱完毕后可选
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