牛奶中金黄色葡萄球菌的检测综述Word文档格式.docx

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葡萄球菌的检验方法，观察金黄色葡萄球菌的革兰氏染色镜检形态。

（3）掌握金黄色葡萄球菌增菌培养技术、分离技术、鉴定技术。

国内外研究现状：

金黄色葡萄球菌是院内感染的常见细菌之一，许多国家都设有专门机构，应对金葡菌的院内感染问题。

随着?

-内酰胺类抗生素的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA随）之增加，且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势。

MRSA可通过接触途径进行传播,即易感人群从携带者或感染者身上获得MRSA,导致传播流行。

美国第一例MRSA发现于1968年,1975年MRSA在临床分离出的金葡菌中仅占2.4%,而1991年则迅速增至29%。

现在美国的某些医院MRSA在临床分离出的金葡菌中可以占到30%-50%。

同样在欧洲的葡萄牙和意大利，MRSA在临床分离出的金葡菌中占50%；

土耳其和希腊>

30%。

荷兰非常低，只有2%，这归功于荷兰人行之有效的控制策略。

在欧洲的调查中，瑞士的流行率最低（1.8%），这主要由于他们在医院内实行了一些新的干预行为，如坚持医护人员的手部卫生管理，以减少MRSA的传播。

在北欧国家MRSA在临床分离出的金葡菌中不足1%。

在芬兰MRSA是非常少见的，直到20世纪90年代医院的病人中只有散发的病例，近几年有报道由不同的流行株引起的医院感染暴发。

同时，MRSA在社区感染中所占的比例也不断增加。

1997年日本报道了第一例耐万古霉素的金葡菌（vancomycin-intermediatestaphylococcusau-reus.VIS）A，表明金葡菌的耐药问题日益严重。

国内情况：

上海地区1977～1979年MRSA占5%,1985～1986年占24%,1990年综合性大医院增至50%,而1993年则上升到60%。

重庆地区1983～1985年为8.3%,1989～1992年上升为18.7%;

1995年北京5家教学医院MRSA分离率平均为47%。

广州地区1990～1995年临床分离的MRSA占金黄色葡萄球菌的比例分别为17.9%、23.5%、30.9%、41.6%、51.9%及56.18%。

其它地区的报道也一般在25%～60%之间,各个地区和医院的MRSA检出率都明显有逐年增加的趋势。

主要参考文献：

（1）《食品微生物检验》（第1版），国家质量监督检验检疫总局职业技能鉴定指导中心主编.北京:

中国计量出版社.2002.

（3）《食品卫生微生物检验标准手册》（第1版），罗雪云、刘宏道主编.北京:

中国标准出版社.1995.

（4）《食品卫生微生物学检验》2003版中华人民共和国国家标准.中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会发布

（5）《药品微生物学检验手册》马绪荣苏德模等主编.科学出版社.2001.

（6）《食品中金黄色葡萄球菌检测方法研究进展》唐俊妮、杨蓉生（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；

王小玲（2.西南民族大学电气信息工程学院，四川成都610041）中图分类号：

TS207.4文献标识码：

A文章编号：

1002-0306（2011）05-0459-03

（7）GB/T4789.食品卫生微生物学检验[S].

（8）陈敏,王颖,顾其芳.巧克力中金黄色葡萄球菌存活及产毒情况观察[J].中国卫生检验杂志,2000,10（5）:

532-533.

（9）徐景野,等.棒冰中金黄色葡萄球菌存活观察[J].中国卫生检验杂

志,1998,8（5）:

293.

（10）汪复,朱德妹,张婴元.上海部分医院细菌耐药监测及其临床意义.中华传染病杂志,1996,14（3）:

148.

二、研究内容、预期成果：

研究内容：

1、形态与染色：

典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。

金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。

2、培养特性：

金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌

氧，最适生长温度37°

C，最适生长pH7.4。

平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。

血平板菌落周围形成透明的溶血环。

金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。

3、生化特性：

可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。

甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。

许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。

金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。

对分型进行简单的了解１、血清学分型：

金葡水解，获得两种抗原成分：

蛋白抗原和多糖抗原。

蛋白抗原是凝集抗原，无特异性。

多糖抗原有特异性。

绝大多数金葡含有A型抗原，B型抗原主要存在于凝固酶阴性菌株，C型抗原在致病性和非致病性菌株中都存在。

２、噬菌体分型：

３、根据肠毒素分型：

４、根据血浆凝固酶分型：

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：

a.溶血毒素：

外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；

b.杀白细胞素：

可破坏人的白细胞和巨噬细胞；

c.血浆凝固酶：

当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。

葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；

d.脱氧核糖核酸酶：

金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；

e.肠毒素：

金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种血清型。

当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。

肠毒素可耐受100°

C煮沸30分钟而不被破坏,它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。

此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶

等。

预期结果：

革兰氏阳性菌染色为蓝色，革兰氏阴性菌染色为红色，金黄色葡萄球菌革兰氏染色为阳性。

三、研究方法和进度安排：

1.研究方法：

（1）.革兰氏染色：

1.1涂片、火焰固定。

1.2草酸铵结晶紫染1min。

草酸铵结晶紫染液的配制：

溶液A：

结晶紫2g，95％酒精20mL，溶液B：

草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。

将A、B溶液混合，用滤纸过滤后即可使用。

1.3自来水冲洗。

1.4加碘液覆盖涂面染约1min。

1.5水洗，用吸水纸吸去水分。

1.6加95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20s后水洗，吸去水分。

1.7沙黄液（稀）染2min后，自来水冲洗。

干燥，镜检。

革兰氏阳性菌染色为蓝色，革兰氏阴性菌染色为红色

（2）.触酶试验：

取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加3％过氧化氢数滴；

或直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。

有大量气泡产生者为阳性，无则为阴性。

2.样品采集：

选取怀疑有金黄色葡萄球菌感染的牛奶进行试验，将其每样取5ml于无菌乳样杯中，待检。

3病原菌的分离培养初步诊断：

将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。

如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为葡萄球菌。

分离培养：

将乳样摇匀，分别取适量接种于营养肉汤（10％血清）、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基（平板）后，置于37℃温箱培养24～48h。

观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现。

普通琼脂平板上，37℃，24～72h培养后，可见到湿润、光滑、隆起的圆形金黄色菌落。

挑取典型菌落涂片、染色、镜检（镜检呈葡萄状排列，无芽胞、荚膜，直径0.5～lμm，革兰氏染色阳性），并挑取单个可疑菌落移植于肉汤和斜面培养基，经37℃培养24～48h。

24h后没有长菌的平板，再用相应的增菌肉汤涂划一次，继续培养，24～48h后，再作检查，以防漏检。

将剩余的乳样存放于4℃冰箱内备用。

营养肉汤中呈浑浊生长，管底有少量灰白色沉淀；

4生化鉴定

触酶试验：

触酶阳性

糖发酵试验：

能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖

色素产生情况：

能产生金黄色色素

5毒力试验

将上述经过生化试验鉴定的细菌悬液用灭菌生理盐水作适当稀释，对随机分组的小鼠进行腹腔注射接种，接种量为0.5mL／只（家兔皮下接种1.0mL或者静脉接种0.1～0.5mL），能够致死动物或者内脏出现脓肿可以确定有毒力。

6病原菌的重分离试验

对接种后发病、死亡小鼠（家兔）的肝脏进行病原菌重分离。

进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株是否为原接种菌。

如果是则进一步确定病原菌为金黄色葡萄球菌。

第一，金黄色葡萄球菌的检验

样品处理：

无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。

增菌培养：

将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°

C培养24小时。

将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°

C培养24~48小时。

金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。

在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2~3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。

染色观察：

从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列的芽孢、荚膜，直径0.5~1μm。

第二，金黄色葡萄球菌肠毒素检测

金黄色葡萄球菌肠毒素的检测主要有动物试验、血清学实验、免疫荧光试验及酶联免疫吸附等方法。

2.进度安排：

2012年07月09日

四、拟利用本实验室的名称及试剂需要：

实验室名称：

微生物实验室

试剂：

牛奶、结晶紫2g，95％酒精20mL，草酸铵0.8g，蒸馏水80mL、番红

染液生理盐水琼脂

五、审批意见：

教师姓名

职称

年月日

学生签名