层析技术的应用Word格式.docx

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分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。

（二）层析法分类见表16-5～7

　　（三）层析法的特点与应用

表16-5　按两相所处状态分类

流动相

液体

气体

液-液层析法

气-液层析法

固定相

固体

液-固层析法

气-固层析法

　　层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。

根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量。

层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层

　　⒋加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。

一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。

样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。

样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。

　　⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。

为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。

　　如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。

湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。

　　⒍凝胶层析的应用

　　⑴脱盐：

高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。

本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。

适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。

柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。

　　⑵用于分离提纯：

凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。

凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。

　　⑶测定高分子物质的分子量：

用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。

测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。

　　⑷高分子溶液的浓缩：

通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

（二）离子交换层析法

　　离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。

　　⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。

溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。

阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；

对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。

洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。

已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。

为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。

柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。

　　⒉加样与洗脱加样：

层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。

样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。

为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。

柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。

　　洗脱：

已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。

为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。

由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。

最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6。

两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。

第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：

　　C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1

　　式中A1、A2分别代表两容器的截面积：

C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；

V为流出体积对总体积之比。

当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。

　　洗脱时应满足以下要求：

①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。

②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。

③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。

目的物的过早解吸，会引起区带扩散；

而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

图16-6　梯度洗脱示意图

　　⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。

依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。

　　⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。

如离子交换纤维素可用2mol/:

NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/lNaOH洗柱；

若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：

0.5mol/lNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。

保存离子交换剂时要加防腐剂。

对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。

有些产品建立用0.02％叠氮钠。

　　⒌离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。

在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。

　　（三）高效液相层析法

　　高效液相层析法（HPLC）是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。

它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。

由于HPLC分离能力强、测定灵敏度高，可在室温下进行，应用范围极广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定的化合物均可用此法测定。

对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。

　　高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致，因而其塔板理论及动力学理论等都可用于高效液相层析。

　　⒈高效液相层析仪典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。

流动相用一高压泵输入。

这种高压泵应满足以下条件：

①流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。

②能抗溶剂腐蚀。

③有较高的输出压力，一般要达到15～300kg/c，也有的高达800kg/c。

④泵的死体积要小。

梯度洗脱装置必须具备两台高压泵，一台输送强溶剂，一台输送弱溶剂，两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的要求改变流动相的组成，以改善分离效果。

一般用微量注射器直接进样，也可采用六通阀门进样。

HPLC中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测，灵敏度可达ng水平。

此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。

　　⒉HPLC的类型与应用

　　⑴液-固吸附层析：

固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。

液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。

流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选择，直接影响色谱的分离情况，一般底剂为极性较低的溶剂，如正已烷、环已烷、戊烷、石油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。

本法可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。

　　⑵液-液分配层析：

固定相为单体固定液构成。

将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。

这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。

另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。

化学键合层析分：

①极性键合相层析：

固定相为极性基团，氰基、氨基及双羟基三种。

流动相为非极性或极性较小的溶剂。

极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，这称为正相层析法，适用于分离极性化合物。

②非极性键合相层析：

固定相为非极性基团，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。

最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。

极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。

本法适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。

离子对分配层析分：

①正相离子对层析：

此法常以水吸附在硅胶上作为固定相，把与分离组份带相反电荷的配对离子以一定浓度溶于水或缓冲液涂渍在硅胶上。

流动相为极性较低的有机溶剂。

在层析过程中，待分离的离子与水相中配对离子形成中性离子对，在水相和有机相中进行分配，而达到分离。

本法优点是流动相选择余地大，缺点是固定相易流失。

②反向离子对层析：

固定相是疏水性键合硅胶，如C18键合相，待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中，生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，而得到分离。

本法优点是固定相不存在流失问题、流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。

　　⑶离子交换层析：

原理与普通离子交换相同。

在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。

流动相主