工农业废料玉米浆和豆饼粉浓.Word文件下载.docx

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Abstract:

Toevaluatethecapabilityofindustrialandagriculturalwastebeinglowcostsubstratesontheexo-biopolymerproductionbycultivatingthemostvaluableandhigh-classediblefungusTricholomamatsutake.Theeffectofcornsteepliquorandsoybeanmealontheexo-biopolymerproduc-tionwasinvestigatedbymeansofsinglefactortestsandresponsesurfacemethodology(RSM)basedonafive-leveltwo-factorcentralcompositede-sign.Experimentfactorsandlevelswerefirstselectedbysinglefactortests.Onthebasisofthis‚theconcentrationofcornsteepliquorandsoy-beanmealwerechosenasthefactorsinRSMandeachfactorinthedesignwasstudiedatfivedifferentlevels.Optimizedvaluesofthefactorsweredetermined:

cornsteepliquor9.07%‚soybeanmeal10.43%andamaxi-mumexo-biopolymerproduction36.2g/L‚whichwas2.6timeshigherthanthecostlytraditionalmedium.Itwaslowcostbyusingcheapanda-bundantsourceofindustrialandagriculturalwastetoreplacetheexperi-mentalreagentsasamediumforcultivatingTricholomamatsutake‚andhasanimportanttheoreticalandpracticalmeaningtotherealizationofthenewbiotechnologyindustry.

基金项目:

2007年雅鹿吉林大学大学生科技创新基金资助项目(项目编号:

2007CX20)

作者简介:

吴昊(1986-)‚男‚吉林大学生命科学学院在读本科生。

E-mail:

wuhao334@sina.com

通讯作者:

孟庆繁

收稿日期:

2008-04-26

Keywords:

Industrialandagriculturalwaste;

Tricholomamatsutakeexo-biopolymer;

Responsesurfacemethodology

松茸(TricholomamatsutakeSing.)又名松口蘑‚属于担子菌纲、伞菌目、口蘑科、口蘑属[1]‚是一种与松树共生形成菌根的珍稀食、药用真菌‚在国际市场上享有“蘑菇之王”的赞誉。

松茸多糖及蛋白是其重要活性成分‚具有明显的增强机体免疫能力和很强的抗肿瘤活性。

然而‚松茸是一种典型的难培养真菌‚迄今尚无人工纯培养栽培出子实体成功的报道[2]。

采用深层培养方法生产松茸并从中提取包括多糖及蛋白等多聚物成分‚以弥补野生松茸资源的严重缺乏已经成为生物工程领域研究的重要课题。

但是‚使用试验试剂培养基成本高‚不利于大规模产业化生产‚为此‚采用价格低廉且来源丰富的工农业废料玉米浆和豆饼粉来取代试验试剂作为培养基的成分进行发酵试验‚并提取其胞外多聚物‚这使成本大大降低。

本试验利用工农业废料液体深层发酵松茸‚将单因素和响应面分析法[3]应用于松茸胞外多聚物产率的优化‚为松茸产业化生产奠定了理论基础。

1材料和方法

1.1材料与仪器

菌株:

松茸(CGMCC5.0793):

中国科学院微生物研究所;

培养基:

斜面培养基采用PDA培养基‚即200g土豆的煮出滤汁‚葡萄糖20g‚KH2PO43g‚Mg2SO4·

7H2O1.5g‚VB150~100mg‚加20g琼脂‚补水至1000mL;

种子培养基:

配制方法同斜面培养基‚不加琼脂;

发酵培养基:

玉米浆、豆饼粉、KH2PO40.1%、MgSO4·

7H2O0.05%、CaCl20.02%、VB10.001%。

HZQ-F160全温振荡培养箱:

哈尔滨市东联电子技术开

发有限公司;

MgSO4·

培养基

装液量50mL/250mL‚接种量4%‚在26℃‚125r/min摇床上培养4d后测定胞外多聚物产量。

结果如图1。

BP221S型电子天平:

德国塞多利斯;

SKPC-01电热恒温鼓风干燥箱:

湖北省黄石市医疗器械厂;

可调式微量取液器:

德国Eppendorf;

MLS-3750型高压自动灭菌锅:

日本SANYO;

超净工作台:

苏净集团安泰公司;

SHB-III型循环水式多用真空泵:

郑州长城科工贸公司;

Centrifuge5810R高速冷冻离心机:

玉米浆、豆饼粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、

VB1、95%乙醇。

1.2培养方法

1.2.1种子培养方法将斜面母种接入PDA综合培养基中‚于26℃下活化培养7d。

斜面菌株活化后‚接入液体种子培养基‚在26℃‚125r/min的摇床培养4d。

1.2.2摇瓶发酵方法将种子液按4%接种量接入发酵培养基‚26℃‚125r/min摇床培养4d。

发酵结束后测定胞外多聚物产率。

1.3胞外多聚物的测定方法

将发酵液离心(5500r/min‚10min)‚上清液加95%乙醇至终浓度为80%‚剧烈震荡‚4℃醇析24h‚离心‚沉淀烘干至恒重‚称重。

1.4胞外多聚物产率计算

胞外多聚物产率(g/L)=胞外多聚物质量(g)/发酵液体积(L)

1.5发酵培养基不同组分对松茸胞外多聚物产率的影响

在发酵培养过程中‚培养基各组分的浓度对最终发酵产

物的产量有很大影响。

利用单因子试验观察了培养基中玉

图1玉米浆浓度对松茸胞外多聚物产率的影响

Figure1Effectofcornsteepliquorconcentration

onexo-biopolymerproduction

从图1可明显看出‚随着玉米浆浓度从1%~9%‚胞外多聚物的产率逐渐增加‚玉米浆浓度为9%时‚胞外多聚物产率最大为10.4g/L。

玉米浆浓度增加到10%胞外多聚物产率反而有所降低。

这说明较高浓度玉米浆对胞外多聚物的产生有一定的抑制作用。

因此选取玉米浆浓度9%进行以下试验。

2.1.2豆饼粉浓度对胞外多聚物产率的影响豆饼粉是大豆(主要是黄豆和黑豆)榨油后的副产品。

从油料中提取的常用方法有两种‚即压榨法和有机溶剂浸提法‚采用压榨法提取油之后的大豆剩余物大多数压制成饼状‚所以被称作豆饼。

一般来讲‚每千克豆饼的干物质中粗蛋白质含量在40%以上。

试验设培养基中豆饼粉浓度分别为6%‚8%‚10%‚12%‚14%‚玉米浆浓度为9%‚KH2PO40.1%、MgSO4·

7H2O0.05%、CaCl20.02%、VB10.001%。

培养基装液量50mL/250mL‚接种量4%‚在26℃‚125r/min摇床上培养4d后测定胞外多聚物产量。

结果见图2。

米浆和豆饼粉浓度对胞外多聚物产率的影响。

在单因子试验的基础上根据中心组合试验设计原理[4‚5]‚采用响应面法在两因素五水平上对松茸胞外多聚物产率的发酵培养基组成进行了优化。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1玉米浆浓度对胞外多聚物产率的影响玉米浆(CSL)是玉米淀粉等产品加工过程中的浸泡水经浓缩至含固形物70%左右后得到的副产品[6]。

制造玉米淀粉须将玉米粒先用亚硫酸浸泡‚浸泡液浓缩即制成黄褐色的液体即为玉米浆。

玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质‚是微生物生长很普遍应用的有机氮源。

试验设培养

基中玉米浆浓度分别为1%‚2%‚3%‚4%‚5%‚6%‚7%‚8%‚9%‚10%‚豆饼粉浓度为2%‚KH2PO40.1%、从图2可看出‚豆饼粉浓度从6%增加到10%胞外多聚物产率迅速增加‚10%以后胞外多聚物产率变化不大‚因此

选取豆饼粉浓度为10%。

2.2培养基的响应面优化

根据单因素探索的试验结果‚以培养基中玉米浆、豆饼粉浓度两个因素为自变量‚胞外多聚物产率为响应值‚采用响应面分析法在两因素五水平上对废料培养基的组成进行优化‚以达到最大限度获取松茸胞外多聚物的目的。

试验因素与水平设计见表1。

复5次‚用以估计试验误差。

采用SASRSREG程序对所得数据进行回归分析‚获得松茸胞外多聚物产率对编码自变量玉米浆、豆饼粉浓度的二次多项回归方程:

Y=35.28569+1.245417x1+2.400417x2-2.937144x1x1-1.90625x1x2-2.631519x2x2‚其中Y为胞外多聚物产率‚x1和x2分别是玉米浆、豆饼粉浓度的编码自变量。

二次响应面模型的变量分析结果见表3。

试验号

x1

x2

胞外多聚物产率/(g·

L-1)

1

-1

22.75

2

31.10

3

29.78

4

30.50

5

-2

22.00

6

26.26

7

20.42

8

30.29

9

38.25

10

31.40

11

36.00

12

36.30

13

36.85

参数

参数估计

标准误

t值

Pr>

|t|

1.24542

0.65272

1.90805

0.09804

2.40042

3.67757

0.00789

x1x1

-2.9371

0.47236

-6

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