完整版三角褐指藻户外高密度培养技术研究毕业设计.docx

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完整版三角褐指藻户外高密度培养技术研究毕业设计

本科毕业设计（论文）

题目：

三角褐指藻户外高密度培养技术研究

学院轻工与食品学院

专业食品科学与工程（糖工程）

学生魏峰

指导教师魏东教授

提交日期2013年06月03日

摘要

三角褐指藻（Phaeodactytuumtricornutunm）是一种常用的海水经济硅藻，生长迅速，易于培养，富含丰富的多不饱和脂肪酸，特别是二十碳五烯酸（C20:

5，EPA），是水产动物养殖的优质饵料。

目前，三角褐指藻的户外高密度培养技术仍处于研发阶段。

为探究不同条件（环境条件和营养盐）对三角褐指藻生长以及其脂肪酸组成和含量的影响，本研究用单一变量法分别对其培养条件进行对比优化实验。

主要结果如下：

（1）选用不同盐度的培养基对三角褐指藻进行户外高密度培养，盐度设定为3个梯度，20‰、25‰、30‰。

结果表明，在盐度为20‰条件下，三角褐指藻的生长状况要优于其他两种盐度，其OD值最高为0.998、细胞密度最高为6.0106个mL、细胞干重最高为177.78mgL。

对脂肪酸的测定结果表明，25‰盐度下三角褐指藻细胞的脂肪酸含量最高（124.95mgg），20‰盐度与25‰盐度基本相同（123.12mgg），而30‰盐度最低（105.67mgg）。

（2）在20‰盐度下，通入CO2控制培养基的不同pH值，对三角褐指藻进行户外高密度培养。

pH值设定为3个梯度，7.5、8.0、8.5。

结果表明，控制pH8.0，三角褐指藻的生长状况要远好于其他两种pH值，其OD值最高为1.045、细胞密度最高为5.8106个mL、细胞干重最高为166.39mgL。

对脂肪酸的测定结果表明，pH值为8.5时三角褐指藻细胞的脂肪酸含量最高（145.91mgg），pH值为8.0的稍低（134.92mgg），pH值7.5的脂肪酸含量最低（109.76mgg）。

（3）在20‰盐度、pH8.0条件下，分别选用碳酸氢铵和尿素作为氮源对三角褐指藻进行户外高密度培养。

结果表明，分别使用碳铵和尿素，三角褐指藻的生长状况基本相同，其最终OD值分别为0.689和0.716，细胞密度分别为3.9106个mL和4.0106个mL，细胞干重分别为136.11mgL和146.11mgL。

但通过对脂肪酸的测定，结果表明当使用碳铵作为氮源时三角褐指藻细胞的脂肪酸含量最高（169.72mgg），尿素作为氮源时脂肪酸含量则相对较低（109.76mgg）。

（4）在20‰盐度，pH8.0，碳铵作为氮源的条件下，当培养基中氮耗尽时，通过一个昼夜24小时对三角褐指藻的取样研究，结果表明，在上午10点钟时，三角褐指藻中所积累的脂肪酸含量最高（136.15mgg），而在其他时间段，脂肪酸的含量则相对较低。

（5）在20‰盐度，pH8.0，碳铵作为氮源的条件下，通过对三角褐指藻的一个生长周期内的氮磷同化规律研究表明，三角褐指藻户外高密度生长过程中，对氮的需求需求量很大，平均每天要消耗10.4mgL的碳酸氢铵。

而对磷的需求则相对较小，每天平均只消耗0.13mgL的磷酸二氢钠。

关键词：

三角褐指藻；盐度；pH值；氮源；脂肪酸

Abstract

Phaeodactytuumtricornutunmisacommonlyusedseawatereconomicdiatoms,rapidgrowth,easytoculture,richinpolyunsaturatedfattyacids,especiallyeicosapentaenoicacid（C20:

5,EPA）,isAquaticanimalbreedingqualitybait.Currently,Phaeodactylumoutdoordevelopmentstage.Toexplorethedifferentconditions（environmentalconditionsandnutrients）onthegrowthofPhaeodactylumandtheirfattyacidcompositionandcontentof,asinglevariablemethodusedinthisstudyweretocomparetheircultureconditionsoptimizationexperiments.Themainresultsareasfollows:

（1）selectionofdifferentsalinitymediaonPhaeodactylumoutdoortheothertwosalinity,itsoffattyacids,25‰salinityPhaeodactylumcellfattyacidcontentofthetheothertwopHvalues,theODvaluesofupto1.045,thesourceforPhaeodactylumoutdoorusingammoniumbicarbonateasanitrogensourcePhaeodactylumcellfattyacidcontentofthesourcewhenthefattyacidcontentisrelativelylow（109.76mgg）.

（4）at20‰salinity,pH8.0,ammoniumbicarbonateasanitrogensourceconditions,whenthemediumisdepletedofnitrogen,24themorning10o'clock,Phaeodactylumfattyacidcontent

oftheaccumulatedmaximum（136.15mgg）,whileinothertimeperiods,fattyacidcontentisrelativelylow.

（5）in20‰salinity,pH8.0,underconditionsofammoniumbicarbonateasanitrogensource,throughPhaeodactylumduringthegrowthcycleofalawofassimilationofnitrogenandphosphorusthatPhaeodactylumoutdoorgreatdemandfornitrogendemand,theaveragedailyconsumptionof10.4mgLofammoniumbicarbonate.Thedemandforphosphorusisrelativelysmall,theaveragedailyconsumptionofonly0.13mgLsodiumdihydrogenphosphate.

Keyword:

Phaeodactytuumtricornutunm;Salinity;pH;Nitrogen;Fattyacid

第一章绪论1

1.1国内外微藻及其脂肪酸研究进展1

1.2硅藻及三角褐指藻概述2

1.3硅藻及三角褐指藻培养技术3

1.4影响硅藻脂肪酸组成和含量的环境因子4

1.5本课题的研背景和意义5

1.6本课题的研究内容5

第二章实验材料与测试方法7

2.1实验材料与仪器7

2.2试验方法7

2.2.1实验室阶段培养8

2.2.2户外培养及采收8

2.3分析与测试9

2.3.1细胞密度、OD值和细胞干重9

2.3.2培养基中氮、磷含量的测定10

2.3.3脂肪酸组成与含量的测定11

第三章不同条件对三角褐指藻生长及脂肪酸积累情况探究13

3.1盐度13

3.1.1实验方法13

3.1.2结果分析13

3.2pH值16

3.2.1实验方法16

3.2.2结果分析16

3.3氮源种类18

3.3.1实验方法18

3.3.2结果分析19

第四章昼夜变化对三角褐指藻脂肪酸组成和含量的影响21

4.1实验方法21

4.2结果分析21

第五章户外培养过程中细胞对氮、磷的同化规律研究23

5.1实验方法23

5.2结果分析23

第五章结果与展望24

参考文献25

致谢27

第一章绪论

1.1国内外微藻及其脂肪酸研究进展

微藻是一类体积小、结构简单、生长繁殖迅速的单细胞藻类。

微藻在海洋生物生态系统中起着重要的作用，他们是构成海洋初级生产力的重要组成部分，是许多海洋动物的优质饵料【1】。

目前在地球上存活的微藻超过20万种，微藻每年固定的CO2大约占全球净光和产量的40%，在能源转化和碳元素循环中起着举足轻重的作用【2】。

微藻种类繁多，生物量巨大，富含着丰富的、结构独特的生物活性物质，如抗生素、类胡萝卜素、虾青素、藻红蛋白、不饱和脂肪酸等在医药和保健品的开发应用方面具有巨大的潜力【3】。

微藻脂肪酸组成的研究多集中在多不饱和脂肪酸（PUFAs）。

微藻含有大量的多不饱和脂肪酸，PUFAs由于在营养、保健和医学上的重要作用，引起了人们广泛的兴趣，特别是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），对维护生物膜的结构和功能，防治心血管疾病、动脉硬化、癌症、风湿关节炎等人类疾病，提高人类的记忆功能都？

有明显的效果【4】。

目前海洋鱼油是EPA和DHA等多不饱和脂肪酸的主要来源，但从鱼油中提取PUFAs会有以下缺点：

鱼油中提取的PUFAs普遍胆固醇含量较高，并带有腥味，极大地影响了产品的品质；鱼油中PUFAs的组成和含量会随着鱼的种类、季节、地理环境等条件的变化而改变；鱼油的加工工艺会降低鱼油中PUFAs的产量，导致产品价格昂贵。

其实鱼类并不是PUFAs的真正生产者，它是通过吞食富含PUFAs的藻类后实现体内PUFAs的积累，因此微藻才是PUFAs真正的生产者【5】。

早在20世纪50年代，国外就对利用微藻生产多不饱和脂肪酸进行了研究，迄今为止，已测定包括硅藻、红藻、金藻、褐藻、绿藻、甲藻、隐藻、蓝藻和黄藻等在内的上百种脂肪酸含量【6】。

目前已经发现小新月菱形藻（Nitzschiaclosterium）、假微型海链藻（Thalssionemapsendonana）、三角褐指藻（Phaeodactylumtricormutum）、小球藻（Chlorllaminutissima）等藻富含EPA。

利用海洋微藻生产PUFAs的研究起始于20世纪80年代初期，并且多以自养微藻生产EPA和DHA为主，其中三角褐指藻、盐生微小绿藻、紫球藻、球等鞭金藻等被认为最有可能实现微藻生产PUFAs产业化。

微藻产业化培养主要有开放大池培养和密闭式光生物反应器培养两种方式。

目前国内外研究人员对利用微藻异养培养生产PUFAs进行了大量研究。

Swaaf等研究了柯氏隐甲藻（Crypthecodiniumcohii）异养培养生产DHA，得到了11.7gL的高产率【7】。

微藻异养生产PUFAs具有相当好的商业应用开发前景，国际上已有Markek和OmegaTech等公司利用微藻异养培养生产PUFAs。

我国微藻养殖方面发展较快，大都是采用开放式或半开放式的培养一些可以作为生物饵料或是食品添加剂的藻类，但是关于微藻工业化生产PUFAs研究得不多。

1.2硅藻及三角褐指藻概述

硅藻是一类单细胞真核生物，硅藻与其他大多数海洋微藻不同的是它们具有一层高度硅质化的细胞壁，从而形成一个坚硬的壳体，壳体由上、下两个半壳组合而成。

硅藻的光合作用色素主要包含叶绿素a、叶绿素c和胡萝卜素、岩藻黄素、硅藻甲黄素等，因此，硅藻的色素体会呈黄绿色或黄褐色【8】。

硅藻大多以单细胞形式存在，也有两个或多个细胞个体连结而成的其他形式的群体。

硅藻的形态多种多样，生长速度快，通常以一分为二的繁殖方法产生。

硅藻是一类重要的海洋浮游生物，其生长分布极其广泛，在地球上的各大海洋中，几乎都有硅藻的踪迹，特别是在热带、亚热带以及温带的大部分海区。

硅藻的种类繁多，数量庞大，素有海洋的“草原”的美誉。

硅藻富含丰富的营养物质，易于消化，特别是脂肪酸含量非常高，硅藻是浮游动物、小鱼、小虾和贝类的优质饵料。

所以，硅藻等浮游类生物的数量多少对水产养殖业起着至关重要的影响。

另外，根据许多数据显示，微藻等海洋浮游生物每年大约可以产生氧气360亿吨，这个数值大约占到了地球上大气氧含量的70%，硅藻又是这些浮游生物中最庞大的群体，可以占到海洋初级生产力的40%左右，所以，硅藻的作用可想而知。

三角褐指藻（Phaeodactytuumtricornutunm）在分类学上属于硅藻门、羽纹纲、褐指藻目、褐指藻属【9】。

三角褐指藻的主要存在形式有三种类型，分别为卵形、梭形和三出放射形，在不同的环境条件下，这三种不同的细胞形态可以互相转变。

在正常的人工培养基条件下培养，三角褐指藻大多是三出放射形细胞和少量的梭形细胞。

三出放射形细胞的长度大约为10-18微米（两臂之间的垂直距离），细胞中心部分有一个细胞核，有1-3片黄褐色的色素。

梭形细胞一般长约20微米，两臂末端较钝。

卵形细胞长约8微米，宽约3微米，有一个硅质壳面，而缺少另一个壳面，也没有壳环带。

三角褐指藻的繁殖通常也是一分为二的方式【10】。

三角褐指藻是一种典型的硅藻，同时更是一种非常具有经济价值的海洋经济类硅藻。

三角褐指藻富含丰富的多不饱和脂肪酸，特别是二十碳五烯酸（EPA），是许多鱼、虾和贝类幼体的优质饵料，尤其是EPA，是这些水产动物所必须的营养物质【12】。

三角褐指藻易于生长，其对环境的适应范围较广，在9‰-92‰的盐度范围内都能正常生存，其最适盐度为20‰-24‰。

适温范围为5-30℃，最适温度为18-24℃，即使是在0℃的条件下仍会有少量三角褐指藻繁殖，但如果超过了35℃细胞就会停止生长，最终接照射【11】。

1.3硅藻及三角褐指藻培养技术

目前国内外硅藻各种规模的培养方式如表1-1所示。

表1-1各种硅藻培养技术的优点和缺点【12】

培养类型示例优点缺点

室内密封条件下用人工配制可人为控制光照，成本高

培养基培养温度，营养元素；

避免污染、天敌

和其它竞争藻类

户外用高级农业肥料在户外成本低难以控制其生长

池塘中培养环境

封闭系统封闭的培养瓶中培养可避免污染成本高

开放系统池塘、水池和跑道池成本低容易被污染

无菌系统消毒玻璃培养皿存活率高，不易污染成本高，难以长期维持无菌系统

非无菌系统成本低容易被污染

连续培养仅限于小规模的室内高效，可连续生产操作困难，复杂

培养高品质硅藻细胞设备费用高

半连续培养室内或室外培养系统简单，效率稍高产品质量不统一

批量培养由试管到池塘培养简单、可靠、灵活效益低，质量不统一，在初始接种和早期生长期间有污染风险，收获、清洁、消毒和接种容器比较麻烦

硅藻的户外大规模培养主要有四大类型：

大型水池培养、大型水箱培养、带有旋转混合器的圆形培养池培养和跑道池培养。

目前硅藻，特别是三角褐指藻高密度户外培养技术仍处于初级开发阶段，国内乃至世界上都还没有一套较为成熟的培养体系，也很难找到较大规模的硅藻海洋饵料生产实例。

所以，要想实现其大规模高密度户外培养，就必须在实际生产过程中对各种培养条件不断地进行优化改进。

目前硅藻户外高密度培养存在的主要问题就是自然环境中光照与温度的难以控制性，以及各种污染带来的影响。

因此，本研究将对三角褐指藻的户外高密度培养条件进行系统的优化，以确定最适宜的培养条件，从而大规模的生产出高质量的三角褐指藻海洋饵料。

户外硅藻大规模的培养产品目前主要是应用于水产养殖行业，作为鱼、虾和贝类幼

体的饵料。

硅藻是饲养海洋双壳类软体动物（蛤、牡蛎、扇贝等）的重要饵料，其富含丰富的脂肪酸，特别是EPA，是这些水产动物的必须营养物质。

硅藻海洋饵料多种多样，其中最为优质的饵料包括角毛藻、海链藻和三角褐指藻等。

根据目前的数据统计表明，在双壳贝类的饲养饵料中海洋微藻类饵料的数量已经超过了90%，其中大多数水产养殖者都选用以上3种硅藻作为首选饵料【12】。

同时许多研究也表明在鱼、虾以及贝类的饲养过程中，如果采用多种饵料混合的养殖方法，通常情况下，饵料中的硅藻会被优先摄入，这表明了硅藻饵料可以在鱼、虾以及贝类的生长过程中提供充足的营养，并且易于捕食，应当是水产养殖业的首选饵料。

1.4影响硅藻脂肪酸组成和含量的环境因子

（1）硅藻自身的影响：

硅藻的脂肪酸组成及含量受自身遗传因素的影响，不同种类硅藻的脂肪酸组成差别很大。

硅藻的主要脂肪酸为C14:

0、C16:

0、C16:

1、C16:

3和C20:

5（EPA），以上5种脂肪酸总含量可以占到总脂肪酸的80%以上。

其中饱和脂肪酸以C16:

0所占比例最大，不饱和脂肪酸C16:

1（n-7）、C16:

3（n-4）和C20（n-3）含量较高。

硅藻中C16:

1（n-7）的含量要高于C16:

0，并且有较高水平的EPA，C16:

3（n-4）的含量也要高于其他藻类【13】。

（2）培养基主要成分氮、磷、硅的影响：

培养基对硅藻脂肪酸组成和含量的影响主要集中在氮、磷、硅。

对多数硅藻来说培养基中氮的含量及其来源对硅藻脂肪酸组成及多不饱和脂肪酸含量有较大影响【14】。

Yongmanitchai等研究发现，三角褐指藻在利用铵、硝酸盐和尿素等作为氮源时，EPA的含量分别占总脂肪酸的25.2%、10.0%、31.8%【15】。

磷是硅藻生长繁殖的必需元素，磷存在于单细胞藻的原生质和细胞核中，参与藻的光合作用、促进酶的活性、起调节作用等【16】。

Yongmanitchai等研究发现，磷对三角褐指藻PUFAs的积累影响很明显，当培养基中磷酸盐的浓度在0.05-0.5gL的范围内对生物量的影响不大，但大于0.5gL时，细胞则不能生长。

磷酸盐浓度在0.1-0.5gL范围内，EPA达到最佳水平【15】。

硅是硅藻生长必不可少的营养元素，除了作为细胞壁结构成分外还参与光合色素、蛋白质、DNA的合成和细胞分裂等多种代谢和生长过程【17】。

硅限制能够导致硅藻脂肪酸百分比组成变化，EPA百分含量增加【18】。

（3）温度：

温度对硅藻中脂类种类的形成起着重要的作用，温度变化也会导致硅藻脂肪酸组分的变化。

温度对硅藻脂肪酸的组成因种而异，总体的趋势是随着温度的降低脂肪酸的不饱和度会增加，这可能是因为温度降低，藻类会通过生产更多的PUFAs来保持细胞膜的流动性【19】，但当温度降低时又会导致硅藻生长缓慢，生物量降低。

（4）盐度：

盐度对硅藻脂肪酸组成的影响也因种而异。

Yongmanitchai等研究发现，当三角

褐指藻的培养基中NaCl浓度为3-5gL时，EPA含量保持稳定；但当NaCl浓度超过5gL时，EPA百分含量会迅速降低【15】。

但无论哪种硅藻，当其处于不适的盐度当中，都会产生一些代谢物以保护自身不受盐分伤害并且保持与环境的渗透平衡【20】。

（5）光照强度：

光照强度是硅藻培养中影响其生长和生化组分变化的重要元素之一。

早期的研究表明，增加光照强度能刺激C16和C18不饱和脂肪酸的合成，主要是C16:

2（n-6）、C16:

3（n-6）、C16:

4（n-3）、C18:

2（n-6）和C18:

3（n-3），增加光照强度还能显著增加甘油三酯的含量【1】。

光照强度对硅藻脂肪酸的组成影响因种而异，多数硅藻在低光照强度时具有较高水平的EPA，DHA含量则随着光照强度的降低而减少【21】。

（6）pH：

不同硅藻生活的最佳pH值不同，偏离最佳pH值，硅藻生长和体内有关代谢活动即受抑制，海洋硅藻生长的最佳pH值与海水的pH值相近约为8.0【22】。

一些研究学者认为pH会影响光合作用中CO2的可用性和硅藻对有机碳源的利用效率，并影响培养基中微藻细胞对离子吸收和利用以及细胞膜的渗透性【23】。

目前有关pH值对海洋硅藻脂肪酸组成和含量的影响的报道较少。

1.5本课题的研背景和意义

三角褐指藻是一种常见的海水经济硅藻，具有适应性强、易于培养的特点，广泛应用于藻类生理、生态研究以及水产养殖和医药行业。

特别是在水产养殖行业，三角褐指藻作为优质的硅藻海洋饵料，发挥着极其重要的作用。

硅藻富含丰富的高度不饱和脂肪酸（PUFAs），特别是二十碳五烯酸（20:

5n-3，EPA）和二十二碳六烯酸（22:

6n-3，DHA）是许多鱼类幼体、对虾幼体以及双壳类幼虫的所必须脂肪酸，关系到其幼虫和幼体的生长发育及存活。

EPA和DHA虽然对有些动物并非必需，但在饵料中适当添加这些物质，可以提高投喂动物的生长速度和存活率。

三角褐指藻中所富含的脂肪酸中EPA所占的比重非常大【】，这就意味着三角褐指藻必将会是水产动物养殖的重要饵料，具有很大的开发和利用潜力。

硅藻中脂肪酸的组成除了受到其自身遗传因素的控制之外，还受到很多培养条件的影响，例如环境因素（营养盐、光照、温度、盐度、pH值）都可导致脂肪酸，特别是EPA含量的变化。

三角褐指藻的生物技术应用及大规模的商业化生产仍处于初级开发阶段，因此户外高密度培养三角褐指藻的条件优化研究对于其大规模商业化生产具有重要意义。

1.6本课题的研究内容

三角褐指藻户外高密度培养条件优化研究，主要分为以下5部分内容：

（1）三角褐指藻户外高密度培养的盐度优化研究：

在一级跑道池（2.5平方米）中，在接种密度及其他条件相同的条件下，分别用20‰、25‰和30‰盐度的消毒海水配制培养基以培养三角褐指藻。

通过对细胞生长速度、细胞密度以及脂肪酸的积累情况进行分析对比，确定户外高密度培养三角褐指藻的最适宜盐度。

（2）三角褐指藻户外高密度培养的pH值优化研究：

在一级跑道池（2.5平方米）中，在接种密度及其他条件相同的条件下，通过通入CO₂分别控制培养基pH在7.5、8.0和8.5以培养三角褐指藻。

通过对细胞生长速度，细胞密度以及脂肪酸的积累情况进行分析对比，确定户外高密度培养三角褐指藻的最适宜pH值。

（3）三角褐指藻户外高密度培养的氮源种类优化研究：

在一级跑道池（2.5平方米）中，在接种密度及其他条件相同的条件下，分别用碳铵和尿素做氮源培养三角褐指藻，比较氮源种类，通过对细胞生长速度，细胞密度以及脂肪酸的积累情况进行分析对比，确定户外高密度培养三角褐指藻的最适宜的氮源种类。

（4）昼夜变化对三角褐指藻脂肪酸组成和含量的影响研究：

在接种密度及其他条件相同的条件下，用碳铵做氮源培养三角褐指藻直到氮源用尽，分析对比在氮饥饿条件下每3小时取样一次，通过对细胞密度以及脂肪酸的积累情况进行分析对比一个昼夜周期中的变化情况，确定三角褐指藻合成脂肪酸与氮源浓度和昼夜变化之间的关系。

（5）户外高密度培养过程中细胞对氮、磷同化规律研究：

在一级跑道池（2.5平方米）、二级跑道池（10平方米）、三级跑道池（40平方米）进行三角褐指藻的户外高密度培养。

在一个生长周期内，通过分析得出三角褐指藻户外高密度培养基中氮磷含量与细胞数、OD值、细胞干重以及脂肪酸变化情况的关系。

第二章实验材料与测试方法

2.1实验材料与仪器

藻种：

三角褐指藻由广东海洋大学黄翔鸿教授赠与。

使用培养基配方（终浓度mgL）[9]：

碳酸氢铵139.5、NaH2PO410、Na₂SiO₃·9H₂O60、EDTANa₂4.35、FeSO₄·7H₂O3.25