细胞实验步骤.docx
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细胞实验步骤
玻璃器械洗消：
一、新的玻璃器皿的洗消：
1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：
烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：
12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：
用清洁液（重铬酸钾120g：
浓硫酸200ml：
蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装：
洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：
包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消：
1．刷洗、烘干：
使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：
烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装：
洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒：
包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。
（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）
5.烘干备用：
因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消：
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。
放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。
橡胶和塑料：
橡胶和制品通常处理方法是：
先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：
1.针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上（凹向上），然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。
注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2.胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。
最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
3.胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。
最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4.胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：
6.其他消毒方法：
有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。
塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。
也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。
用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。
其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。
密写墨水的配制：
氯化钻（CoC12?
6H2o）2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。
注意事项：
1.严格执行高压锅的操作规程：
高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。
检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
2.安装滤膜时注意光面朝上：
注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：
A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。
B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。
C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。
PCR实验操作程序
1.在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：
反应物加样顺序体积（μl）终浓度
去离子水129.4
10×BufferB251×
4×dNTP混合物35各200μmol/L
MgCl2431.5mmol/L
有义引物52.60.25μmol/L
反义引物62.60.25μmol/L
模板720.1μg
TaqDNA聚合酶80.41unit
2.用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。
每加一管换一次Tip。
3.振荡每只管，然后短暂离心。
4.将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：
预变性94℃4分钟1次
变性94℃1分钟
退火37-65℃1分钟
延伸72℃1分钟
循环30次
终延伸72℃7分钟1次
保存4℃
5.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。
电泳条件：
60-80V,15-20分钟。
6.紫外分析仪检查电泳结果。
四、讨论
1.假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：
①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
③模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。
酶失活：
需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
引物：
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：
①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：
Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：
通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：
变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：
如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：
选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：
这种污染有两种原因：
一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：
①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：
①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
4.出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：
①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
PCR及RT-PCR之基础问题解答
1.问题：
RT-PCR灵敏度：
在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；
在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；
如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。
而且，在≥0.8mMDTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
2）RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法：
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。
用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。
可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：
SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法：
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议解决方法：
确定退火温度适合您的引物。
对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo（dT）或随机六聚体.
确定GSP是反义序列。
5）起始RNA量不够
建议解决方法：
增加RNA量。
对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6）RNA模板二级结构太多
建议解决方法：
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.
提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：
不要在＞60℃时使用oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。
对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：
不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
7）引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议解决方法：
在PCR前用RNaseH处理。
8）靶序列在分析的组织中不表达
建议解决方法：
尝试其他靶序列或组织
9）PCR没有起作用
建议解决方法：
对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
2.问题：
PCR灵敏度：
在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1）PCR引物设计较差
建议解决方法：
避免在引物3'端含有互补序列。
避免可以形成内部发卡结构的序列。
设计Tm类似的引物。
2）DNA含有抑制剂
建议解决方法：
诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制TaqDNA聚合酶。
如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。
3）富含GC的模板
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用PCRxEnhancerSolution。
4）模板浓度太低
建议解决方法：
使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
5）镁离子浓度太低
建议解决方法：
从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
注意：
对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。
6＝退火温度太高
建议解决方法：
使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm5℃。
因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
7＝引物浓度太低
建议解决方法：
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。
为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
3.问题：
RT-PCR特异性：
在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因：
1＝物和模板非特异性退火
建议解决方法：
在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo（dT）。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
2＝GSP设计较差
建议解决方法：
遵循用于扩增引物设计的同样原则
3＝RNA中沾染了基因组DNA
建议解决方法：
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。
使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
4.问题：
PCR特异性：
在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因：
1＝形成引物二聚体
建议解决方法：
设计在3'端没有互补序列的引物。
2＝引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
使用PlatinumTaqDNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
3＝镁离子浓度太高
建议解决方法：
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
4＝因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法：
使用巢式PCR或递减PCR。
5＝沾染外源DNA
建议解决方法：
使用抗气雾剂的tip和UDG。
6＝因为二级结构导致引物结合位点无法接近
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRxEnhancerSolution。
5.问题：
PCR忠实性：
PCR在产物序列中引入了错误
可能原因：
1＝聚合酶忠实性低
建议解决方法：
使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如PlatinumPfxDNA聚合酶。
2＝循环数太多
建议解决方法：
降低循环数。
3＝四种dNTP的浓度不同
建议解决方法：
制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。
使用预混合物。
从RNA抽提到电泳鉴定
RNA抽提
一，准备工作
1，实验器具与材料：
（1）移液枪：
1ml、200ul、10ul
（2）吸头：
1ml、200ul、20ul
（3）吸头台：
放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个
（4）EP管1.5ml、100ul
（5）玻璃研磨器
（6）容量瓶：
1000ml
（7）盐水瓶：
100ml
（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）
2，实验器具的处理与准备
（1）塑料制品：
（包括吸头、EP管等）
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
（2）玻璃制品：
（主要是玻璃研磨器）
先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。
（3）金属制品：
（镊子等）
先洗干净，再送干烤3次。
（不需要泡DEPC水）
3，试剂配制和准备：
（1）DEPC水：
泡实验器具的DEPC水的配制：
1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。
配75％乙醇的DEPC水的配制：
100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。
（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：
用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:
无水乙醇＝1:
3），然后放于-20℃备用。
（3）异丙醇：
放入棕色瓶
（4）氯仿：
放入棕色瓶
（5）Trizol：
100ml/瓶存放于4℃
二，抽提时注意事项：
全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三，抽提步骤
1．匀浆化作用
取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。
颠倒混匀10下，室温静置5分钟。
2．分离阶段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。
盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。
后12000rmp离心15分钟。
3．RNA的沉淀
将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。
4．RNA的洗脱
小心倒掉上清，留取沉淀。
加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。
5．RNA的再溶解
小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。
注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。
再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。
6，RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。
TRIzol法抽提总RNA细胞
组织100mg1×107
↓
加1mlTRIzol
↓细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
匀浆（要彻底，后转至EP管）
（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）
↓
颠倒混匀15S，室温5分钟
↓
4℃，离心12000rmp，15分钟
↓
转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇（约400-500μl），混匀后-20℃中1小时
↓
4℃，离心12000rmp，10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml
↓
4℃离心7500rmp，5分钟
↓
弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）
↓
立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录
逆转录（RT）
一，准备工作
1，实验器具与材料：
（1）移液枪：
200ul、10ul
（2）吸头：
200ul、20ul
（3）EP管1.5ml、100ul
（4）水浴箱
2，实验器具的处理与准备
塑料制品：
（包括吸头、EP管等）
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
3，试剂配制和准备：
（1）DEPC水：
泡实验器具的DEPC水的配制：
1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。
逆转录中所用的DEPC水的配制：
100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。
（2）RT中所需要的各种试剂
（3）引物浓度计算方法：
（新合成的引物的稀释）假如终浓度为XuM（pmol/ul）加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量×X）
二，RT时注意事项：
为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
三，RT步骤
用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）
1，准备0.65ml的EP管
2，冰上操作：
在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。
3，65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4，短暂离心后，冰上操作：
加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAseInhibitor，1ulSSⅢ逆转录酶。
5，短暂离心
6，50℃水浴60分钟进行逆转录。
7，70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8，-20℃保存，或立即进行PCR。
用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）
1，准备0.65mlEP管
2，加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA
3，稍离心，100℃沸水裕1min
4，加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆转录酶
5，稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT
6，100℃沸水裕3min灭活AMV
7，立即PCR或-20℃保存。
聚合酶链式反应（PCR）
二，准备工作
8，实验器具与材料：
（1）移液枪：
200ul、10ul
（2）吸头：
200ul、20ul
（3）吸头台：
放置200ul和20ul的吸头一个
（4）EP管1.5ml、100ul
2，实验器具的处理与准备
（1）塑料制品：
（包括吸头、EP管等）
送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。
3,试剂配制和准备：
（1）双蒸水：
100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。
（2）PCR中所需要的各种试剂
三，PCR时注意事项：
佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
四，PCR步骤
1，准备100ulEP管
2，依次在管中加入：
（50ul反应体系）
ddH2O37.5ul×？
10mMdNTP1ul×？
10×PCRbuffer5ul×？
25mMMgcl2（加之前要摇匀）3ul×？
上游引物1ul×？
下游引物1ul×？
模板cDNA1ul
3，稍离心
4，100℃沸水浴1分钟
5，趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作）
6，再加入50ul液体石蜡封闭
7，10000rmp离心1分钟
8，PCR条件
94℃1min
58℃50sec
72℃1min30sec
进行40个循环，然后72℃10min完
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