细胞实验步骤.docx

1、细胞实验步骤玻璃器械洗消： 一、新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时

2、，维持20-30分钟。7.高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消： 1刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指

3、针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消： 金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。橡胶和塑料： 橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序： 1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要

4、装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 2. 胶塞烘干后用2氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 4. 胶头可用75酒精浸泡

5、5分钟，然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶，培养板，冻存管： 6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。 为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12?6H2o)2g，30盐酸

6、10m1，蒸馏水88m1。 注意事项： 1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。 3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。PCR实验操作程序 1. 在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：反应物 加样顺序 体积(l

7、) 终浓度去离子水 1 29.410Buffer B 2 5 14dNTP混合物 3 5 各200mol/LMgCl24 3 1.5mmol/L有义引物 5 2.6 0.25mol/L反义引物 6 2.6 0.25mol/L模板 7 2 0.1gTaqDNA聚合酶 8 0.4 1unit2. 用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50l矿物油。每加一管换一次Tip。3. 振荡每只管，然后短暂离心。4. 将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：预变性 94 4分钟 1次变性 94 1分钟退火 37-65 1分钟延伸 72 1分钟循环30次终延伸 72 7分钟 1次保存 45. 将PCR产

8、物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。电泳条件：60-80V,15-20分钟。6. 紫外分析仪检查电泳结果。四、讨论1.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有Taq酶抑制剂，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是P

9、CR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响

10、很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这

11、也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。2.假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能

12、耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来

13、源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。4.出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。PCR及RT-PCR之基础问题解答 1. 问题：RT-PCR灵敏度：在琼

14、脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因： 1）RNA被降解 建议解决方法： 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA； 在将组织从动物体取出后立刻处理在100甲酰胺中储存RNA； 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25g到0.4g/l）以帮助小量样品RNA的恢复。 逆转录抑制

15、剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。 将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。 3）多糖同RNA共沉淀 建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 建议解决方法： 确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25保温10分钟。 对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体. 确定GSP是反义序列。 5）起始RNA量不够 建议解决方法： 增加RNA量。 对于50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0

16、.1g到0.5g乙酰BSA。 6）RNA模板二级结构太多 建议解决方法： 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火. 提高逆转录反应温度，对SuperScript可以到50，对ThermoScript可以到65。 注意：不要在60时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于1kb的RT-PCR产物，保持反应温度65。 注意：不要在高于37时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。 7）引物或模板对残余的RNA模板敏感 建议解决方法： 在PCR前用RNaseH处理。 8）靶序列在分析的组织中不表达 建议解决方法： 尝试其他靶序列或组织

17、 9）PCR没有起作用 建议解决方法： 对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。 2.问题：PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因： 1）PCR引物设计较差 建议解决方法： 避免在引物3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 2）DNA含有抑制剂 建议解决方法： 诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。 3）富含GC的模板 建议解决方法： 对于GC含量50的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 4）模板浓度

18、太低 建议解决方法： 使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。 5）镁离子浓度太低 建议解决方法： 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。 6退火温度太高 建议解决方法： 使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。7引物浓度太低 建议解决方法： 最佳引物浓度介于0.1M到0.5M之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。 3.问题：RT-PCR特异性：

19、在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 可能原因： 1物和模板非特异性退火 建议解决方法： 在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。 试用允许高温cDNA合成的GSP。 2GSP设计较差 建议解决方法： 遵循用于扩增引物设计的同样原则 3RNA中沾染了基因组DNA 建议解决方法： 使用扩增级DNase处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。 4.问题：PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 可能原因： 1形成引物二聚体 建议解决方法： 设计在3端没有互补序列的引物。 2引物和模板非特异性退火 建议解决方法： 以2到5间隔增加退火温度，减少退火时间。

20、在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。 避免在引物3端含有2到3个dG或dC。 3镁离子浓度太高 建议解决方法： 对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。 4因为扩增复杂模板导致引物错误起始 建议解决方法： 使用巢式PCR或递减PCR。 5沾染外源DNA 建议解决方法： 使用抗气雾剂的tip和UDG。 6因为二级结构导致引物结合位点无法接近 建议解决方法： 对于GC含量50的模板，使用（1-3）PCRx Enhancer Solution。 5.问题：PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误 可能原因： 1聚合酶

21、忠实性低 建议解决方法： 使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。 2循环数太多 建议解决方法： 降低循环数。 3四种dNTP的浓度不同 建议解决方法： 制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。从RNA抽提到电泳鉴定 RNA抽提一，准备工作1， 实验器具与材料：（1） 移液枪：1ml、200ul、10ul（2） 吸头：1ml、200ul、20ul（3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4） EP管1.5ml、100ul（5） 玻璃研磨器（6） 容量瓶：1000ml（7） 盐水瓶：100ml（8） 15ml塑

22、料管一个（配75乙醇用）2， 实验器具的处理与准备（1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37过夜，然后送至高压3次，后在80烘烤箱中烘干（或置于37中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1DEPC水中泡8小时左右，37烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。（3） 金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3， 试剂配制和准备：（1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量

23、瓶中静置4小时后备用。配75乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37过夜，送至高压。（2） 75乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇1:3），然后放于-20备用。（3） 异丙醇：放入棕色瓶（4） 氯仿：放入棕色瓶（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。三，抽提步骤1匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Tr

24、izol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2分离阶段每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3RNA的沉淀将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20中1小时，后12000rmp离心10分钟。4RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。5RNA的再溶解小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意

25、不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60下孵育10分钟助溶。6，RNA的保存提取的RNA保存于-70超低温冰箱中，或立即用于逆转录。 TRIzol法抽提总RNA细胞 组织100mg 1107加1mlTRIzol 细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆（要彻底，后转至EP管） （组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管）颠倒混匀10下，室温5分钟加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）颠倒混匀15S，室温5分钟4，离心12000rmp，15分钟转上层水相（约400-500l）于另一新1.5mlEP管中加等体积异丙

26、醇（约400 -500l），混匀后-20中1小时4，离心12000rmp，10分钟弃上清加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml4离心7500rmp，5分钟弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）溶于DEPC水中至20l（10l-20l）（可在55-60水中，10分钟助溶）立即保存于-70超低温冰箱中，或立即用于逆转录 逆转录（RT）一，准备工作1， 实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）EP管1.5ml、100ul（4）水浴箱2，实验器具的处理与准备塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1DEPC水中（

27、必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37过夜，然后送至高压3次，后在80烘烤箱中烘干（或置于37中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20中保存备用。（2）RT中所需要的各种试剂（3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）（OD33

28、1000000）/（分子量X）二，RT时注意事项：为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。三，RT步骤用SS逆转录酶进行RT（20ul体积）1， 准备0.65ml的EP管2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。3， 65水浴5分钟后，立刻0冰水浴至少1分钟。4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SS逆转录酶。5， 短暂离心6， 50水浴60分钟进行逆转录。7， 70水浴15分钟灭活逆转录酶8， -20

29、保存，或立即进行PCR。用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）1， 准备0.65mlEP管2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA3， 稍离心，100沸水裕1min4， 加入0.5uldNTP，2ul 5Buffer，1ul AMV逆转录酶5， 稍离心，封口膜封口，42水浴90作RT6， 100沸水裕3min灭活AMV7， 立即PCR或-20保存。聚合酶链式反应（PCR）二，准备工作8， 实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul2，实验器具的处理与

30、准备(1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。3, 试剂配制和准备：(1) 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20中保存备用。(2) PCR中所需要的各种试剂三，PCR时注意事项：佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。四，PCR步骤1， 准备100ul EP管2， 依次在管中加入：（50ul反应体系）ddH2O 37.5ul ？10mM dNTP 1ul ？10PCR buffer 5ul ？25mM Mgcl2（加之前要摇匀） 3ul ？上游引物 1ul ？下游引物 1ul ？模板cDNA 1ul3， 稍离心4， 100沸水浴1分钟5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作）6， 再加入50ul液体石蜡封闭7， 10000rmp离心1分钟8， PCR条件94 1min58 50sec72 1min30sec进行40个循环，然后72 10min 完