ELISA系列讲座下.docx

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ELISA系列讲座下

4.7结果判断

　　4.7.1定性测定

　　定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。

"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。

"阴性"则为无反应。

用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。

在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。

根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。

在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。

在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。

两类反应的结果判断方法不同，分述于下。

（1）间接法和夹心法

这类反应的定性结果可以用肉眼判断。

目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。

但在ELSIA中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。

阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。

在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。

目视法简捷明了，但颇具主观性。

在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。

先读出标本（sample，S）、阳性对照（P）、和阴性对照（N）的吸光值，然后进行计算。

计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。

a．阳性判定值

阳性判定值（cut-offvalue）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。

用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。

阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。

现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。

试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9±2ng/ml。

每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。

测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数（NCX）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（P-N）必须大于一个特定的数值（例0.400），试验才有效。

3个阴性对照A值均应≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX；如有两个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。

阳性判定值按下式计算：

阳性判定值=NCX+0.05

标本A值＞阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。

应注意的是，式中0.05为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。

根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生"试验无效"的后果。

b.标本/阴性对照比值

在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。

在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。

也有写作P/N的，这里的P不代表阳性（positive），而是病人（patient）的缩写，不应误解。

为避免混淆，更宜用S/N表示。

在早期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为各种测定所沿用。

实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。

更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。

有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。

因此，这类试剂盒规，如N<0.05（或其他数值），则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。

（2）竞争法

　　在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。

阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应最为敏感。

竞争法ELISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。

计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。

a.阳性判定值法

　　与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。

试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为125±100u/ml。

每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。

测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值（NCX）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如0.300）,试验才有效。

3个阴性对照A值均应小于2.000，而且应≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另2个阴性对照重新计算×NCX；如有2个阴性对照A超出以上范围，则该次实验无效。

阳性判定值按下式计算：

阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

标本A值≤阳性判定值的反应为阳性，A＞阳性判定值的反应为阴性。

b.抑制率法

抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：

抑制率（%）=（阴性对照A值-标本A值）×100%/阴性对照A值

一般规定抑制率≥50%为阳性，＜50%为阴性。

4.7.2定量测定

　　ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。

测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。

　　测定小分子量物质常用竞争法（参见2.2），其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。

标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。

ELISA技术中的抗原与抗体的反应

抗体

1.2.1　抗体的结构

　　抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。

Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。

与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。

Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。

Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。

五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。

IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。

　　重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。

两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合抗原的结构基础。

IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。

每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。

另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。

　　IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab'）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。

　　IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。

IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000。

　　机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。

经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。

IgM抗体一般为保护性抗体具有免疫性。

因此IgM抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。

右图为为甲型肝炎病人血清中IgG抗体和IgM抗体出现的时间和水平。

1.3　抗原抗体反应

1.3.1　可逆性

抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：

Ag+Ab→Ag•Ab

抗体的亲和力（affinity）是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数K表示：

K=[Ag•Ab]／[Ag][Ab]

　　Ag•Ab的解离程度与K值有关。

高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。

解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。

在抗血清中，特异性的IgG抗体仅占总IgG中的极小部分。

用亲和层析法提取的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。

1.3.2　最适比例

　　在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图1-4。

曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zoneofequivalence）。

在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。

如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象（zonephenomenon）。

抗体过量称为前带（prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。

在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。

1.3.3　特异性

　　抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。

由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。

例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。

抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

　　但是这种特异性也不是绝对的。

假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交叉反应。

例如：

绒毛膜促性腺激素（hCG）和黄体生成激素（LH）均由α和β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。

用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体，抗α-hCG抗体将与LH中的

α酶位发生交叉反应。

在临床检验中，如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。

因此在作为早孕诊断（敏感度应达到50mIu/mlhCG）的实际中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。

1.3.4　敏感性

　　在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。

标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。

例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。

1.4　免疫测定在临床检验中的应用

　　由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广，在临床检验中可用于测定：

1）体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。

2）激素，包括小分子量的甾体激素等。

3）抗生素和药物。

4）病原体抗原，HBsAg、HBeAg等。

5）另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs等。

5．标记的免疫测定

　　如上所述，免疫测定是一种很敏感的测定方法，抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度，敏感度可达5~10μg/ml，但在临床检验中