利用TRIzol试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA.docx
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利用TRIzol试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA
利用TRIzol_试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA.txt“我羡慕内些老人羡慕他们手牵手一直走到最后。
━交话费的时候,才发现自己的话那么值钱。
第30卷第
5期
西安交通大学学报
(医学版
)Vol.30No.5
2009年
10月JournalofXipanJiaotongUniversity(MedicalSciences)Oct.2009
利用
TRIzoló试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总
RNA
李冬民
1,2,任吴超
1,2,王 璇
1,2,王飞苗
1,2,高 玉
1,2,
韩 燕
1,2,宁启兰
1,2,宋天保
1,3,吕社民
1,2
(西安交通大学医学院
:
1.环境与疾病相关基因教育部重点实验室
;2.遗传学与分子生物学系
;
3.人体解剖学与组织胚胎学系
陕西西安
710061)
摘要
:
目的 建立胰腺高质量总
RNA快速、经济、稳定的提取方法。
方法 应用
TRIzoló试剂和液氮提取大鼠胰腺总
RNA,通过总
RNA含量和
A260/280比值的测定及
10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳评估总
RNA的质量
并用
RT2PCR检
测大鼠胰岛素
1、胰高血糖素、胰α2淀粉酶和
β2actin的表达。
结果 利用
TRIzoló和液氮提取的大鼠胰腺总
RNA量
可达到
3~6μg/mg胰腺组织
A260/280比值在
1.75~1.89之间。
在
10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳时
均可见
28S及
18S条带
并且在
28S、18S条带间可见明显的云雾状阴影。
大鼠胰岛素
1、胰高血糖素、胰α2淀粉酶、
β2actinRT2PCR
产物电泳结果显示均有清晰的条带。
结论 应用
TRIzoló试剂和液氮成功地提取了大鼠胰腺高质量的总
RNA,后者
可用于
RT2PCR研究。
关键词
:
大鼠胰腺
;总
RNA提取
;TRIzoló试剂
;液氮
中图分类号
:
Q813 文献标志码
:
A 文章编号
:
167128259(2009)0520639204
RENWu2chao1,2,WANGXuan1,2,WANGFei2miao1,2
HANYan1,2,NINGQi2lan1,2,SONGTian2bao1,3
(1.KeyLaboratoryofEnvironmentandGenesRelatedtoDiseases,
MinistryofEducationofChina/
AmethodwithTRIzolóreagentandliquidnitrogento
extracthigh2qualityRNAfromratpancreas
LIDong2min1,2,GAOYu1,2,
LBShe2min1,2
MedicalSchoolofXipanJiaotongUniversity,Xipan710061;
2.DepartmentofGeneticsandMolecularBiology,MedicalSchoolof
XipanJiaotongUniversity,Xipan710061;3.DepartmentofHumanAnatomy,
HistologyandEmbryology,MedicalSchoolofXipanJiaotongUniversity,Xipan710061,China)
ABSTRACT:
Objective Toestablishaquick,economicalandreproduciblemethodforhigh2qualityRNA
extractionfrompancreas.Methods WeutilizedTRIzol
ó
ReagentandliquidnitrogentoisolatetotalRNAfrom
theratpancreas.TheRNAqualitywasdeterminedbydetectionofitscontentandopticdensity(A)at260/280nm,
andelectrophoresisin1%non2denaturedagarosegel.Thenreversetranscription2polymerasechainreaction(RT2
PCR)wasperformedtodetectexpressionofthepancreas2specificgenes.Results ThecontentofthetotalRNA
extractedfromtheratpancreasreached3-6μg/mgpancreatictissues,andA260/280ratiowas1.75-1.89.
ElectrophoresisofthetotalRNAshowed28Sand18SrRNAbandswithclearsmearbetweenthem.TheRT2PCR
productsofpancreas2specificgenesincludinginsulin1,glucagon,α2amylaseandhousekeepinggeneβ2actinall
exhibitedclearbandson1%agarosegel,whichwerelocatedintheexpectedpositions,respectively.Conclusion
Theseresultssuggestthatwehavesuccessfullyisolatedthehigh2qualityandintactRNAfromtheratpancreaswith
TRIzol
ó
Reagentandliquidnitrogen.TheextractedtotalRNAcanbeusedinRT2PCRforpancreaticgeneexpres2
sion.
KEYWORDS:
ratpancreas;totalRNAextraction;TRIzol
ó
reagent;liquidnitrogen
收稿日期
:
2008212223 修回日期
:
2009203218
基金项目
:
国家自然科学基金资助项目
(No.30400249;30571725;30630058);陕西省国际科技合作重点项目
(No.20072KW206);陕西省自然科学
基金资助项目
(No.2004C256);陕西省卫生厅基金资助课题
(No.D204028)
SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30400249;30571725;30630058),theInternationalCooperational
FoundationofShaanxiProvince(No.20072KW206),theNaturalScienceFoundationofShaanxiProvince(No.2004C256),andthe
FoundationofHealthDepartmentofShaanxiProvince(No.D204028).
通讯作者
:
宋天保
教授
博士生导师
.E2mail:
songtbao@;吕社民
教授
博士生导师
.E2mail:
lushemin@mail.xjtu.edu.cn
作者简介
:
李冬民
(19702),女
(汉族
),博士
.研究方向
:
2型糖尿病等代谢性疾病的分子发病机制
.
6 40西安交通大学学报
(医学版
)第
30卷
1968年
COX用盐酸胍代替酚作为蛋白质变性
剂
建立了分离纯化
RNA的方法。
1979年
CHIR2
GWIN成功地利用异硫氰酸胍裂解、并以氯化铯为
基质经超高速离心从富含核糖核酸酶的组织中
分离
到未降解的
RNA,并成为当时提取
RNA的主要方
法。
1987年
CHOMCZYNSKI和
SACCHI在联合
应用异硫氰酸胍和酚提取
RNA的基础上
建立了用
酸性异硫氰酸胍
2酚2氯仿抽提一步法分离
RNA的方
法
由于省略了以氯化铯为基质经超高速离心这一步
骤
分离
RNA的时间缩短为
4h,不但使
RNA的产
量和纯度大大提高
而且还可从微量的细胞和组织中
提取
RNA。
这种提取
RNA的方法被广泛应用
并
且被商业化。
尽管目前已能成功地从原核生物、真核
生物的多种组织和细胞中提取
RNA,但由于胰腺易
自溶和富含内源性核糖核酸酶
[1],导致很难获得高质
量的胰腺
RNA,给研究胰腺组织的基因表达带来很
表
1 大鼠胰腺中表达的
4个基因的引物序列和扩增片段大小
大困难。
我们经过反复试验
利用
TRIzoló试剂和液
氮从大鼠胰腺组织中成功提取完整的
RNA,可用于
RT2PCR、Northernblotting、差异显示、抑制性消减
杂交及芯片等的研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级
E3雌性大鼠
4只
体重
220~250g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.2 主要试剂及仪器
TRIzoló试剂
(Invitrogen公
司);反转录试剂盒
RevertaidTMFirstStrandcDNA
Synthesis(Fermentas公司
);TaqDNApolymerase
(TaKaRa公司
)。
蛋白核酸定量仪
CE2321
(GENEGUEST);凝胶成像系统
(SYNGENE);PCR
热循环仪
PTC2200(BIO2RAD)。
用
PrimerPrimier
5.0设计
PCR引物
并由上海桑尼生物科技有限公
司合成
引物序列见表
1。
2AGCAAGCAGGTCATTGTTCC23′
2TTGCGGGTCCTCCACTTC23′
2ACCGTTTACATCGTGGCT23′Senseprimer:
5′
Antisenseprimer:
5′
Senseprimer:
5′
Antisenseprimer:
5′
Tab.1 TheprimersequenceandsizeofPCRproductsofthe4genesexpressedintheratpancreas
GenePrimersequence
SizeofPCRproducts
Senseprimer:
5′
Insulin1209bp
Antisenseprimer:
5′
Glucagon
492bp
2GTCTCTGGTGGCAAGGTTAT23′
2ACATTGGTGTAGCAGGGTT23′
α2amylase
318bp
2CAAGGGCTCTGTCAGTAGG23′
Senseprimer:
5′2CACCCGCGAGTACAACCTTC23′
β2actin207bp
Antisenseprimer:
5′2CCCATACCCACCATCACACC23′
1.3 大鼠胰腺的取材和保存 取材所用的器械
180
℃干烤
6h,不能干烤的塑料制品用
1mL/LDEPC
水
37℃处理过夜
高压烤干后备用。
戊巴比妥钠麻
醉
E3大鼠
快速取胰腺尾部组织约
20~30mg,装
入
DEPC处理过的冻存管中
液氮中保存或液氮速
冻后
-80℃保存备用。
1.4 利用
TRIzoló和液氮提取大鼠胰腺总
RNA
将胰腺组织从液氮或
-80℃低温冰箱中取出
立即
放入装有适量液氮的研钵中迅速研磨成粉末
研磨过
程中始终保持研钵内有液氮。
然后
将胰腺组织粉末
移入
1.5mL的
EP管中
加入
1mLTRIzoló,剧烈
震荡
30s,并在室温放置
5min。
加入
0.2mL氯仿
剧烈振荡
15s,室温放置
3min,4℃12000×g离心
15min,样品分为
3层
:
上层无色水相
下层粉红色有
机相
中间白膜层。
将上清转移至另一新的
DEPC
处理过的
1.5mLEP管中
(此步绝对不能吸入中间
白膜层
),加入
0.5mL异丙醇
混匀后
-20℃放置
30min。
4℃12000×g离心
10min,弃去上清
用
750mL/L乙醇洗涤
RNA胶样沉淀。
4℃
7500×g
离心
5min,室温放置
10~15min干燥
加入
60μL
DEPC水溶解
RNA沉淀后
280℃保存。
若长期保
存
RNA也可用无
RNA酶的去离子甲酰胺溶解。
1.5 大鼠胰腺总
RNA定量及
A260/280比值鉴定 用
99μLDEPC水稀释总
RNA1μL后
用核酸
/蛋白质
微量定量仪检测大鼠胰腺总
RNA的含量及
A260/280
比值。
1.6 10g/L非变性的琼脂糖凝胶电泳检测大鼠胰
腺总
RNA 电泳
RNA所用器械如制胶的模具、梳
子、电泳槽等用
30mL/L过氧化氢溶液浸泡
30min,
用
DEPC水冲洗
3遍
室温晾干备用。
用对
RNA酶
有抑制作用的
DEPC水配置电泳缓冲液
TAE及其
他所有溶液。
用新的
0.5×TAE配制
10g/L琼脂糖
凝胶
溴化乙锭
(EB)直接加入凝胶中。
点样时
样品
RNA每
2.5μL加入
0.5μL6×上样缓冲液
以
5V/cm电压电泳
30min左右取出凝胶
在凝胶成像
系统观察所提取的
RNA并拍照记录。
1.7 RT2PCR法检测胰岛素
1、胰高血糖素、胰α2淀
粉酶和
β2actin的表达 按照
RevertaidTMFirst
5期李冬民
任吴超
王 璇
等.利用
TRIzoló试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总
RNA
StrandcDNASynthesisKit操作说明
反转录合成
cDNA第一链。
逆转录反应体系总体积
20μL,含胰
腺总
RNA5μg、M2MULV逆转录酶
(200u/μL)
1μL。
cDNA合成后保存在
-80℃冰箱中备用。
PCR扩增大鼠胰岛素
1、胰高血糖素、胰α2淀粉
酶和
β2actin:
取高压灭菌的
0.2mL的
PCR小管
4
支
分别依次加入
10×PCRBuffer2.5μL、dNTP
Mixture(各
2.5mmoL/L)2μL、TaqDNApoly2
merase(5u/μL)0.125μL、上下游引物各
1μL、cD2
NA0.5μL、灭菌蒸馏水
17.875μL,反应总体积
25μL。
混匀后
短暂离心。
反应条件
:
94℃
5min,
94℃1min,60.3℃
1min,72℃
1min延伸
共
32
个循环
最后
72℃10min。
产物鉴定
:
取
20μLPCR
扩增产物在
10g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定
用凝胶
成像系统进行分析。
2 结 果
2.1 大鼠胰腺总
RNA定量、
A260/280比值及
10g/L
非变性琼脂糖凝胶电泳结果 利用TRIzoló试剂和
液氮提取的4只E3大鼠胰腺总RNA量可达到3~6
μg/mg胰腺组织,A260/280比值在1.75~1.89之间。
在10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳时,均可见28S及
18S条带,28S与18S条带灰度比值大于1.8,并且在
28S和18S条带间可见明显的云雾状阴影(图1)。
RNA的提取是分子生物学中最常用的操作技术
之一。
由于mRNA分子容易受到核糖核酸酶的破坏
而降解,加上核糖核酸酶广泛存在且极为稳定,因此
图
1 利用
TRIzoló试剂和液氮提取的大鼠胰腺总
RNA
的
10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳
Fig.110g/Lnon2denaturedagarosegelelectrophoresisof
thetotalRNAisolatedfrompancreasof4E3rats(1-4)
withTRIzolóreagentandliquidnitrogen
2.2 RT2PCR法检测大鼠胰腺特异性基因的表达
RT2PCR产物的
10g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示
大
鼠胰腺特异性表达基因胰岛素
1(209bp)、胰高血糖素
(492bp)和胰
α2淀粉酶
(318bp)以及管家基因
β2actin
(207bp)均有清晰的条带
未见非特异性扩增
(图
2)。
图
2 大鼠胰腺特异性表达基因
RT2PCR产物的
10g/L
琼脂糖凝胶电泳
Fig.2RT2PCRanalysisofproductsofpancreas2specific
genesfromratpancreason10mL/Lagarosegel
M:
DNAmarker;1:
insulin1;2:
glucagon;3:
amylase;4:
beta2
actin
3 讨 论
抑制核糖核酸酶的活性成为
RNA提取过程中的关
键问题。
常规的组织和细胞
RNA的提取要求所有
与
RNA接触的仪器和装置都要严格处理
以尽量减
少外源性
RNA酶污染造成的
mRNA降解
[2]。
然而
对于易于自溶和富含内源性
RNA酶的胰腺组织的
RNA提取
常规方法因不能完全抑制
RNA酶活性
而使胰腺
RNA的提取失败。
目前
仅有少量文献报
道胰腺组织的
RNA提取方法
主要有两种
:
①原位
胰腺导管灌注
RNA酶抑制剂
然后提取
RNA[3];②
将新鲜胰腺组织样品保存于
RNAlater2ICE中
用液
氮或干冰速冻后
提取
RNA[425]。
第一种方法由于胰
腺导管灌注成功与否是提取胰腺完整
RNA关键
因
而要求有很高的导管穿刺技术
穿刺失败
则前功尽
弃
因而重复性差
;第二种方法也是目前研究中主要
用的方法
但由于所用试剂较多
步骤繁琐
也不容易
在众多实验室推广。
商业所售的
TRIzoló试剂提取总
RNA,实质上
是酸性异硫氰酸胍
2酚2氯仿抽提一步法分离
RNA[6]。
按照
TRIzoló试剂操作步骤通过匀浆可非
常容易地提取多种组织的
RNA。
如果直接用匀浆法
破碎富含核糖核酸酶的胰腺组织
由于胰腺组织中的
细胞不容易迅速与裂解液
TRIzoló试剂充分接触
RNA酶不能迅速被灭活而致提取的
RNA降解。
因
此
在抑制
RNA酶活性的同时
使组织充分的裂解
6 42西安交通大学学报
(医学版
)第
30卷
降解问题也就迎刃而解。
RNA酶活性在低温环境
(液氮、干冰
)或
RNA酶抑制剂中可被完全抑制
[728],
与干冰和
RNA酶抑制剂相比
液氮具有更经济、易
于获得的优点。
在研究中
我们利用
TRIzoló试剂和液氮经过
50余次的实践
最终成功提取了大鼠胰腺高质量的
总
RNA。
总
RNA定量、
A260/280比值测定和
10g/L
非变性琼脂糖凝胶电泳结果均提示
所提取的大鼠胰
腺总
RNA没有降解
完整性很好。
为了进一步鉴定
所提取的
mRNA的质量及其是否可以用于下游实
验
如
RT2PCR、Northernblotting、差异显示、抑制
性消减杂交、芯片等的研究
我们选用
RT2PCR检测
了大鼠胰腺特异性基因的表达。
结果显示
不但管家
基因
β2actin条带清晰
而且胰腺内分泌部特异性表
达基因胰岛素和胰高血糖素以及外分泌部特异性表
达基因胰
α2淀粉酶
在
marker所指示的位置均有清
晰的条带
没有非特异性扩增条带。
在设计引物时
我们特别注意选择位于不同外显子上的上下游引物
从而保证了RT2PCR模板来源于mRNA反转录后
的cDNA,而非DNA。
利用TRIzoló和液氮提取大鼠胰腺高质量总
RNA的方法,不但经济、简单方便,而且重复性好。
但在具体操作中有几点要特别注意:
①取胰腺组织的
动作一定要快;②胰腺组织在-80℃保存前一定要
用液氮速冻;③研磨过程中要及时添加液氮,保证胰
腺组织在研磨时一直浸在液氮中