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万古毒素键合硅胶整体柱的制备及其在毛细管电色谱中的应用
董晓莉，董靖，欧俊杰，朱岩，邹汉法
固定硅胶载体是作为手性固定相，以分离对映体的中央大环抗生素万古霉素。
单片石英毛细管柱的制备是采用溶胶-凝胶过程在一个内径为50毫米的石英毛细管内，然后在对万古霉素作为一个手性拆分还原胺化原位的固定化。
通过对映选择性在非水极性有机或水的流动相中得到了八个对映体，其中大部分是高柱效基线分离。
有人指出，极性有机流动相（甲醇/乙腈）中的有机调节剂比例控制分辨率和对映体的效率起到了重要的角色。
普萘洛尔对映体的分离，在无水流动相的柱效和分辨率的可重复性相对标准偏差在1.1-2.3％（N=5）的行与行注射和7.2-9.6％（N=5）。
沙利度胺在水溶液中的流动相为柱与柱的测试分离的可重复性相对标准偏差分别在1.5，2.8％和6.1，10.5％。
关键字：
毛细管电色谱、拆分对映体、硅胶整柱、万古毒素DOI10.1002、elps.200600605
1前言
目前，微柱技术的发展解决了常规液相技术难以解决的问题，具有低进样量，低固定相和流动相消耗量，环保，易于和质谱联用等特点，因此它已成为分离科学研究中的热点和趋势。
在手性拆分上的应用也越来越广泛，例如微柱液相（CLC）[40,148-150]、毛细管电泳（CE）[151-156]和毛细管电色谱（CEC）[48,90,157-164]；其中CEC在手性分离上的应用尤为突出。
CEC既具有电泳的高效性，亦具有高效液相色谱的高选择性，成为近几年发展最为迅速的色谱技术，逐渐成为当代色谱学发展的一个新方向。
很多在液相色谱中应用的手性固定相，都已通过电色谱柱技术应用于电色谱中。
毛细管电色谱柱的制备是CEC的心脏，而原位制备的毛细管整体柱（monolithiccolumn）是CEC中的热点研究课题。
这种色谱柱制备方法简单，由于使用的聚合方法中的功能单体多样化，因此该类柱种类丰富多彩，可根据需求不同制备出满足条件的整体柱。
此外，毛细管整体柱还可以避免制作塞子的麻烦，并克服塞子易产生气泡的不足。
目前已有很多手性毛细管整体柱用于CEC分离的报道[50,66,165]。
作为一类重要的整体柱类型，硅胶整体柱在继承了硅胶基质机械强度好，柱效高，寿命长，表面积大和易于化学修饰等优点的同时，还由于具有独立可控的通孔和中孔结构而克服了填充柱柱压过大的不足，且其非手性特异性作用小，是手性固定相优良的载体介质，在手性分离中有着广泛的应用。
目前，应用在硅胶整体柱上的手性固定相包括蛋白类[30,107,108,166]，环糊精类[111]，离子交换型[114]，配体交换型[49,50]和纤维素类[110,167]。
大环抗生素是Armstrong等人[32]首次将其引入到手性固定相作为选择试剂，它的选择性较高，成为一类重要的且新兴的手性选择试剂。
其发展极为迅速,在高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、毛细管电泳（CE）、毛细管电泳－质谱（CE-MS）和毛细管电色谱（CEC）等都有广泛应用，对其分离机理的研究也逐步深入[168,169]。
近年来它们也成为CEC分离中具有良好应用前景的手性选择试剂[97,170-174]，其手性作用机理是：
这些物质具有多个能够形成氢键的手性中心，还存在较多的芳香基团，此外其立体结构是一个大空腔结构，这些都是手性识别赖以存在的必备条件；大环抗生素能够广泛应用的另外一个重要因素即其溶解性好。
它既具有疏水基团，又具有亲水基团，因此易溶于缓冲溶液，微溶于有机溶剂，这对于其修饰到手性介质形成CSP提供了方便。
此外，它们在CEC缓冲溶液中具有足够的稳定性。
其中万古霉素是抗生素中手性选择能力最强的抗生素之一[97,172-174]，并且常被键合到硅胶颗粒表面然后填充到毛细管中用于CEC研究。
填充柱虽然柱容量大，但是制备复杂，且在CEC分离中容易产生气泡，因而它们的应用受到限制。
Kornysova等人将键合万古霉素的聚丙烯酰胺整体柱用于CEC手性药物分离[137,175]，但其手性识别能力却不尽如人意，只有四种药物能被拆分。
而目前还没见到过采用万古霉素键合的硅胶整体柱用于CEC分离的报道。
利用溶胶-凝胶（sol-gel）技术制备的硅胶整体柱具有渗透性好，表面积大，机械强度高，柱寿命长等点，并且易于改性。
因此我们认为采用毛细管硅胶整体柱作为万古霉素CSP的载体能够充分利用硅胶整体柱良好的骨架结构，进一步提高其手性选择性及柱床稳定性。
在本章工作中，我们将万古霉素化学键合到毛细管硅胶整体柱整体柱表面，并成功地将其用于CEC手性分离。
2材料与实验
2.1实验部分
2.1.1药品与试剂
试剂：
正硅酸甲酯（TMOS）购自武汉大学化工厂（武汉）。
聚乙二醇（PEG,Mn=10,000）购自Aldrich公司（Milwaukee,WI,USA）。
3－缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷购自Sigma-Aldrich（Gillingham，Dorset，英国）；尿素购自华美生物工程公司；万古霉素购于新昌制药厂。
甲醇及乙腈为色谱纯；磷酸氢二钠（分析纯，上海新华化工厂），磷酸二氢钠（分析纯，沈阳试剂三厂），甲醇（分析纯），乙腈（色谱纯），其它所用样品均为分析纯。
所有实验用水由Milli-Q（Millipore,Bedford,MA,USA）超纯水净化装置制备。
安息香（benzoin），吲哒帕胺（indapamide），托格尔碱（Tröger’sbase），吡喹酮（praziquantel），阿普洛尔（alprenolol）,阿替洛尔（atenolol），美托洛尔（metoprolol），特布他林（terbutaline），吲哚洛尔（pindolol），普萘洛尔（propranolol），华法令（warfarin）和酮基布洛芬（ketoprofen）购自Sigma公司（St.Louis,MO,美国）；联苯类化合物DDB和DDBA由刘月启博士提供；四氢巴马亭（tetrahydropalmatine），雷诺嗪（ranolazine），羟嗪（hydroxyzine）由中国生物样品检定所提供。
设备：
Waters510液相色谱泵（Waters公司，USA）用于冲洗毛细管柱。
恒温水浴锅（龙口市科学仪器公司，中国）用于加热毛细管。
气相色谱仪（依利特公司，大连）用于加热毛细管。
显微镜XSP-16A用于观察毛细管柱。
流动相为磷酸盐缓冲溶液-乙腈。
所有溶液均用超纯水配制，用0.45µm滤膜过滤。
材料:
毛细管为50mμmI.D.×375mμmO.D.熔融石英毛细管，购于河北永年光导纤维厂。
2.1.2毛细管内壁的预处理
首先用0.1mol/LNaOH溶液冲洗石英毛细管30min，然后用去离子水冲洗10
min；接着用0.1mol/LHCl溶液冲洗毛细管2h，再用去离子水冲至流出液为中性；最后用甲醇冲洗10min，并用氮气吹干。
图2.1对映体化合物的结构式
Fig2.1Structuresofthetestedenantiomers
2.1.3毛细管硅胶整体柱的制备
毛细管硅胶整体柱的制备参考文献[176]的方法。
具体过程是：
首先将0.88克PEG、0.90克尿素溶于10mL醋酸溶液（约0.01mol/L）中，在冰浴中缓慢滴加4.4mL正硅酸甲酯，搅拌45min，可观察到成均一透明的溶胶；然后将此溶胶注入预处理好的毛细管中，两端用橡胶密封后放入40℃的水浴过夜；再将其置于120℃的气相色谱柱温箱中，使其中的尿素分解成氨，在氨的作用下完成整体柱中孔结构的构建，再依次用水、甲醇冲洗，在室温下缓慢干燥；待彻底干燥后将整体柱置于气相色谱柱温箱中，以1℃/min的速率从室温升到110℃，保持90min，继续以1℃/min的速率升到330℃保持900min，除去其中的有机成分。
2.2毛细管硅胶整体柱表面键合万古霉素
键合反应过程如图2.2.1所示。
先用0.1mol/LHCl溶液冲洗毛细管硅胶柱3h，接着用去离子水冲至流出液为中性，再用甲醇冲洗10min，最后用氮气吹干。
量取20μL的3－缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（3-GPTS），溶于200μL的无水甲苯中，将此反应液装入气压罐中，用氮气压力使其充满整根硅胶整体柱，然后将此毛细管柱置于110℃的气相色谱仪柱温箱内反应10h，待反应完成后用甲醇冲洗30min，通氮气吹干。
为了将环氧官能团进一步反应得到具有高反应活性的醛基，需要将其开环得到二醇，具体方法为：
先用10mM的HCl溶液冲洗毛细管硅胶柱6h，接着用去离子水冲至流出液为中性，然后将70mM的高碘酸钠溶液（溶剂为水/甲醇，4/1，v/v）充分浸润柱床并于室温下反应2h，反应完后用去离子水充分冲洗。
至此，环氧转化醛基的过程已完成。
将一定量的万古霉素溶于50mM的磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中，然后用注射器将此溶液注入表面已生成醛基的硅胶整体柱（长度为20cm）中，两端用橡胶塞密封，室温反应6h。
键合完成后，由于硅胶整体柱表面仍残留大量的醛基，故进一步采用10mM的硼氰化钠溶液冲洗柱床2h，将残留的醛基还原成羟基，然后用流动相充分平衡1h待CEC评价。
图2.2.1毛细管硅胶整体柱键合万古霉素的制备过程示意图
Fig2.2.1Schematicrepresentationofpreparationproceduresofvancomycin
derivatizedsilicamonolithiccolumn.
（1）Open-tubularcapillary;
（2）silicamonolith;（3）silanolsonthesurfaceofsilicamonolith;（4）glycidylationonthesurfaceofsilicamonolith;（5）formationofaldehydegrouponthesurfaceofsilicamonolith;（6）formationofvancomycinimmobilizedsilicamonolith.
在这里值得一提的是，用CEC评价该固定相时发现被测试的对映体化合物的响应都很低，检测灵敏度低不利于本实验继续进行。
这是由于本法制备的键合万古霉素硅胶整体柱的柱床表面存在大量的万古霉素分子，而它是一种强紫外吸收的物质，因此导致柱上紫外检测时响应太低。
而且硅胶基质的整体柱在制作检测窗口时不能采用灼烧的办法将窗口的固定相除去。
在本工作中，为了解决硅胶整体柱上检测灵敏度低的问题，我们利用Teflon的接头将16cm长的键合万古霉素的硅胶柱与一段15cm长的空毛细管连接，然后将空毛细管有效长度处用刀片刮去毛细管外壁的聚酰亚胺涂层1-2mm，制成电色谱柱检测窗口（如图2.2.2所示）。
将毛细管柱装入毛细管电泳仪的卡盒之后，按分离要求切去两端多余毛细管。
图2.2.2毛细管柱检测窗口示意图
Fig2.2.2Schematicrepresentationofnewpreparedvancomycinmonolithcoupledwithfusedsilicacapillary
2.3电色谱实验
电色谱实验在P/ACETMSystemMDQ（Beckman,Fullerton,CA,USA）上完成。
检测器为紫外二极管阵列检测器（UV-PDA），色谱柱的总长为31cm，有效长度为16cm，通过一个Teflon的接头与一段15cm长的空管相连接，内径都是50μm。
实验前先用流动相冲洗30min，用电压平衡时，在开始的10min内电压缓慢地从0V增加到10kV，然后电压稳定在10kV。
选用丙酮为死时间标记物。
采用电动进样，进样时间为1s，进样电压为5kV，检测波长214nm，操作电压5-25kV。
实验结果中的容量因子（k1′，第一个流出的对映体），手性分离因子（α），分离度（Rs）以及柱效（N1，plates/m）的计算公式如下：
其中t1，t0分别为样品第一个流出峰的保留时间和分离系统的死时间；w1，w2分别为两个对映体峰的半峰宽；L为色谱柱长度（cm）
3结果与讨论
3.1整体柱的表征
图1是在内径为50μm毛细管中制成硅胶整体柱横截面的扫描电镜图。
从图中可以清楚看出硅胶整体柱具有均匀连续的网状骨架结构，硅胶床层既具备大的贯穿孔（~2μm），提供硅胶整体柱的高渗透性；在骨架的表面还存在许多中孔，它是整体柱高比表面积的保证，而这是提高手性分离度的重要因素。
此外还可以观察到床层通过化学键键合牢牢的连接在毛细管内壁上，这为整体柱的稳定性提供了保证。
图1键合万古霉素硅胶整体柱的电镜扫描图
Fig1SEMphotographsofmonolithicsilicainsideacapillaryatmagnificationsof（a）1500×and（b）5000×.
在万古霉素键合的硅胶整体柱的性能评价实验中，首先考察了电压对电流的影响，结果如图2所示。
在流动相为MeOH/ACN/HAc/TEA（80/20/0.1/0.1,v/v/v/v）的条件下，当电压由1kV增大到20kV时，电流也随之线性增大（相关系数为0.9990）。
该结果表明在此电色谱条件下柱内的焦耳热可忽略不计，这为快速分离提供了保障。
图2万古霉素键合毛细管硅胶整体柱电流和分离电压的关系
Fig2Dependenceofappliedvoltageonthecurrent.Experimentalconditions:
Experimentalconditions:
column,a16cm×50μmIDmonolithicsilicacolumnmodifiedwith10mg/mLvancomycinattachedtoa15cm×50μmIDemptyfused-silicacapillaryviaaTeflon-tubingunion;mobilephase,MeOH/ACN/HAc/TEA（80/20/0.1/0.1,v/v/v/v）；appliedvoltage,10kV;injection,5kV×1s.
电渗流是评价一根电色谱柱的第一要素。
制备的万古霉素固定化硅胶整体柱在极性有机流动相（MeOH/ACN/HAc/TEA,80/20/0.1/0.1,v/v/v/v）的条件下，产生由阳极到阴极的电渗流，以丙酮作为电渗流标记物测得EOF达1.23×10-4cm2V-1s-1，在极性有机流动相的环境下该EOF可认为是较大的。
连续五次进丙酮样品考察整体柱的稳定性，测得其保留时间的相对标准偏差（RSD）小于0.82％，说明保留值重现性良好，万古霉素硅胶整体柱具有可靠的稳定性。
另外，还对制备的整体柱在反相模式的流动相（含20％乙腈的10mM磷酸三乙胺缓冲液，pH6.5）条件下，测得其EOF大小为1.38×10-4cm2V-1s-1，连续五次测得的RSD为0.75％，综上所述，我们制备的万古霉素硅胶整体柱无论在极性有机模式还是反相模式下都能产生较高的电渗流，而且重现性良好，为该整体柱手性固定相能够在CEC中进行评价提供了必要的前提。
3.2键合条件的优化
为了将万古霉素固定在50μm内径的毛细管硅胶整体柱表面，首先在其表面先键合一层含环氧官能团的硅烷化试剂，然后将其酸化氧化成醛基，醛基可以和万古霉素上的伯氨基发生还原反应，得到键合了万古霉素的硅胶整体柱。
为了获得更好的稳定性，重复性以及分离能力，我们对键合反应中万古霉素的反应浓度进行了考察。
分别采用5mg/mL，10mg/mL和15mg/mL的万古霉素反应液和已衍生醛基的硅胶整体柱进行柱上反应，然后分别考察了在所制备的电色谱柱上对映体化合物的拆分。
图2.6列出了propranolol和alprenolol分别在5mg/mL，10mg/mL和15mg/mL万古霉素反应液改性的电色谱柱上的分离图。
从图中可以看出，对映体的保留时间和分离度都随万古霉素反应浓度的增大而增大，但是当反应浓度一再提高到15mg/mL时，保留时间和分离度的变化甚微，说明此时万古霉素的键合量已经达到饱和。
由于硅胶整体柱上的醛基位点也有限，一味提高万古霉素的浓度来增大键合量反而浪费样品量。
综上所述，利用还原胺化反应来固定万古霉素时，反应浓度采用10mg/mL即可。
图2.6propranolol和alprenolol在不同电色谱柱上的分离谱图
Fig2.6Electrochromatogramsforseparationofpropranolol（a）andalprenolol（b）ondifferentcolumns.Experimentalconditions:
column,16cm×50μmIDmonolithicsilicacolumnmodifiedwith5mg/mL
（1）,10mg/mL
（2）or15mg/mL（3）vancomycinsolutionattachedtoa15cm×50μmIDemptyfused-silicacapillaryviaaTeflon-tubingunion;appliedvoltage:
10KV；injection,5kV×1s;
2.2.3极性有机模式和反相模式拆分对映体
极性有机流动相的首次应用是在HPLC的CD[177]和抗生素[32]的手性固定相上。
在无水极性有机环境下，一些非手性选择性的相互作用特别是疏水相互作用都能被大大减弱。
因此，在这种模式下的手性选择性往往比反相模式下的高，特别适用于有机聚合物基质的手性固定相。
极性有机流动相往往是以氢键作用较弱的乙腈为主要溶剂，另外辅以甲醇，三乙胺或醋酸为改进添加剂。
据文献报道，在大环抗生素的手性固定相上，低乙腈高甲醇结合少量醋酸和三乙胺的流动相更有利于手性拆分[173]。
另外，此种流动相和反相流动相相比会导致较低的电流，因此在CEC应用中能尽可能避免气泡的产生，使得评价能够顺利进行。
本实验首先采用极性有机相模式考察万古霉素键合的硅胶整体柱的手性拆分能力，所用流动相条件和结果等色谱数据列于表2.1。
在所测试的八种对映体中，有六种为碱性药物，它们是一类用于治疗高血压的β－受体阻滞剂。
从表中可以看出制备的万古霉素手性固定相具有较好的手性识别能力。
六种碱性药物在极性有机流动相条件下都能实现基线分离且达到了很高的柱效，最高可达217000塔板数/米。
万古霉素键合的硅胶整体柱分离β-阻滞剂的典型电色谱图如图2.7所示，它们均能够被基线分离，而且分析速度快，6min之内全部完成分离。
该六种碱性药物的pKa都大于9，在现有流动相下都带正电荷，它们的电泳方向和电渗流方向是一致的，因此它们的出峰都在死时间之前。
这说明在该整体柱上的手性分离中，电泳机理也起着一定的作用。
传统的HPLC中，万古霉素手性固定相拆分β-阻滞剂也很常见[150,178]，但是它存在分离时间过长，拖尾严重以及系统平衡时间过长等缺陷。
而在本实验中，六个β-阻滞剂都能获得很好的拆分，并且分离时间短，在6min之内全部出峰，在流动相中添加了三乙胺之后拖尾现象也不明显。
表1对映体化合物在极性有机相和反相模式下拆分的电色谱数据
Table1Racemiccoumpoundsseparatedinthenon-aqueouspolarorganicandaqueousmobilephases.
Compounds
Mobilephase
t1
（min）
t2
（min）
N1
（plates/m）
N2
（plates/m）
Rs
Propranolol
a
4.11
4.31
116300
111400
2.01
Pindolol
a
4.27
4.43
208700
217400
1.85
Metoprolol
a
4.01
4.17
145000
106900
1.35
Atenolol
a
5.56
5.85
107200
63500
1.31
Terbutaline
a
4.66
4.87
83300
53400
1.14
Alprenolol
a
3.30
3.45
58750
52000
1.08
Thalidomide
b
8.98
10.22
48500
49650
2.93
Benzoin
b
10.38
10.58
129300
82200
0.57
Experimentalconditions:
column,a16cm×50μmIDmonolithicsilicacolumnmodifiedwith10mg/mLvancomycinattachedtoa15cm×50μmIDemptyfused-silicacapillaryviaaTeflon-tubingunion;mobilephase,（a）MeOH/ACN/HAc/TEA（80/20/0.1/0.1,v/v/v/v）;（b）10mMtriethylaminephosphatebuffercontaining20%ACNatpH6.5;appliedvoltage,10kV;injection,5kV×1s;.
两个中性化合物安息香和沙立度胺的拆分是在反相流动相（含20％乙腈的10mM磷酸三乙胺缓冲溶液，pH6.5）下实现。
沙立度胺的分离度较高（Rs＝2.93），而安息香获得部分分离（Rs＝0.57）。
同时也考察了反相模式下β-阻滞剂的分离，但是其分离柱效较低，且拖尾严重，拆分未能实现。
说明该手性固定相在极性有机环境下更有优势，这可能是由于极性有机流动相对消除非特异性相互作用有着重要作用。
图3对映体化合物在极性有机相和反相模式下的电色谱拆分谱图
Fig3Electrochromatogramsforseparationsofenantiomersundernon-aqueousandaqueousmobilephases.ExperimentalconditionswerethesameasdescribedinTable2.1.
参照2.1.4节的键合万古霉素的方法，我们也进一步考察了键合万古霉素的聚（GMA-co-EDMA）毛细管电色谱整体柱在CEC手性分离中的效果，但是无论在极性有机模式还是反相模式β-阻滞剂和沙立度胺都未能拆分。
可能原因为有机聚合物整体柱的比表面积小不利于手性选择试剂键合量的提高，且有机基质的强疏水性导致非手性特异性作用增大，而手性相互作用减弱[136]。
而硅胶整体柱具有高比表面积，高柱效以及非特异性作用弱的特点，因此选择硅胶整体柱作为万古霉素手性固定相的基质优势明显，这与文献[114]报道的极为吻合。
组合化学的蓬勃发展使得人们可以在短时间内制备出大
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