1新生血管肿瘤生物治疗首尔肺癌通过抑制内皮祖细胞抑制血管新生CN.docx

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1新生血管肿瘤生物治疗首尔肺癌通过抑制内皮祖细胞抑制血管新生CN

CancerBiology&Therapy13:

7,504-515;May2012

人参皂苷Rg3通过抑制内皮祖细胞的生物活性减弱肿瘤血管形成

Jae-WonKim,2Seok-YunJung,1Yi-HongKwon,2Jun-HeeLee,1YouMieLee,3Boo-YongLee2,*andSang-MoKwon1,*

现有的证据显示，人参皂苷Rg3似乎可通过抑制细胞增殖、肿瘤细胞侵袭和转移而抑制包括Lewis肺癌、肠腺癌或B16黑素瘤等肿瘤的生长。

内皮祖细胞（EPC）似乎通过干预血管生成开关促进肿瘤新血管形成（通过在肿瘤进展过程中产生血管生成细胞因子），在早期肿瘤生长中发挥关键作用。

本文报道人参皂苷Rg3（一种候选的抗癌生物分子），通过抑制EPC的多种生物活性对肿瘤血管形成的一种新机制。

将人参皂苷Rg3加入到离体培养快速增殖的EC（一类EPC）中，可抑制EPC的细胞增殖、细胞迁移和管腔形成。

重要的是，在体外，人参皂苷Rg3减弱了VEGF依赖性的p38/ERK信号磷酸化级联反应。

异种移植肿瘤模型明确显示，人参皂苷Rg3通过抑制骨髓微环境动员EPC至外周循环和调节VEGF-依赖性的肿瘤血管形成而抑制肿瘤生长和肿瘤血管形成。

总之，本研究提供了一种潜在的治疗性分子即人参皂苷Rg3，通过抑制EPC的生物活性的抗癌药物。

关键词：

肿瘤血管生成，内皮祖细胞，人参皂苷Rg3，VEGF信号，抗血管生成

引言

实体瘤的非受控性生长与肿瘤血管形成密切相关，主要通过输送肿瘤细胞生存所需的营养素和氧气，同样提供一个转移扩散途径；所以，适当控制肿瘤血管形成是一种颇具吸引力的肿瘤治疗靶点1，2。

近来，诸多已有的证据表明了骨髓源性干/祖细胞的重要性，因为这些指向肿瘤脉管系统的祖细胞和内皮细胞涉及诱导肿瘤新血管形成3，4。

促血管生成细胞包括内皮祖细胞（EPC，快速增殖的EC）、造血前体细胞、间充质干细胞（MSC），通过损伤性动员促进因子[如血管内皮生长因子（VEGF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、可溶性c-kit配体（s-cKitL）和/或基质衍生的因子-1（SDF-1）]从骨髓（BM）中动员，以加速实体瘤的生长5，6。

重要的是，LydenD等证明骨髓衍生内皮细胞和造血前体细胞的募集受损可阻断肿瘤血管形成和生长7。

同样，现有诸多证据提示，EPC加速早期肿瘤的生长（通过干预血管生成开关促进肿瘤进展过程中肿瘤血管新生）与肿瘤血管形成密切相关7-11。

因此，适当抑制功能性级联反应，如促血管生成祖细胞的动员步骤、启动BM微环境至外周血和新血管形成过程中通过特定的分子掺入到缺血肿瘤组织的步骤，是一种有效并且颇具前景的抗癌策略12，13。

不过另一方面，这些通过干/祖细胞促进抑制肿瘤血管生成的靶向生物分子的作用尚不明确。

近来，已报道了一系列广泛的、源自食用和药用植物的天然物质具有抗癌性和抗突变性，部分归因于其植物素的化学防癌活性，包括抗炎和抗氧化生物活性14，15。

亚洲国家的民间医学中使用人参治疗各种疾病已有数千年，因为它具有广泛的药理学作用和治疗作用，诸如中枢神经系统、免疫系统和心血管系统中的生物调节、抗缺氧性应激和抗衰老活性。

人参的效应包括一般的“滋补作用”、抗疲劳、抗应激、免疫调节和抗癌16，17。

人参皂苷Rg3是一种从人参中提取的单体成分，可抑制肿瘤细胞的生长、诱导细胞凋亡。

现有诸多证据显示，人参皂苷Rg3通过抑制肿瘤生长而使多种肿瘤的侵袭与转移得到抑制，包括Lewis肺癌18，19、肠道腺癌、B16黑素瘤20，21，同时能够抑制前列腺癌细胞的增殖。

在肿瘤进展过程中，VEGF信号是肿瘤血管形成过程的重要方面，因为它与肿瘤的快速增殖、侵袭和转移密切相关，可导致致病性血管的快速增殖22。

同样，业已建立VEGF信号或单克隆抗体以及VEGF小分子抑制剂和其受体已被证实能够抑制肿瘤生长23-25。

为了阐明干/祖细胞促肿瘤血管生成的分子机制，近期有许多研究已经证明：

VEGF信号在上调的诸多的EPC细胞功能，诸如细胞迁移、增殖、生存和血管形成中发挥关键作用26。

在缺氧的肿瘤组织部位，募集的EPC分泌大量的VEGF，并促进异常血管网的形成。

这种肿瘤中形成的血管网常常易渗漏和出血，部分归因于过量产生的VEGF（也称之为血管通透性因子，VPF）。

除了明确的血管形成效应之外，有证据表明：

过量产生的VEGF还可增强肿瘤炎症7，27。

作为VEGF介导的EPC生物学以调节EPC迁移、增殖、生长和生存的下游信号级联反应，EPC活化的两种主要信号通路为磷脂酰肌醇-3-激酶-AKT和Raf-MEK-细胞外信号调节激酶（ERK）通路，似乎也与促进肿瘤血管生成有关28，29。

因此，在试图阻断肿瘤血管生成治疗各类临床癌症患者时，VEGF靶向分子将可能为有效地控制肿瘤血管生成提供一种颇具前景的癌症治疗方法。

确定调节VEGF诱导的肿瘤血管形成的物质，是天然产物筛选研究的主要关注点。

例如，芹黄素是一种天然产物，可通过降低HIF-1α和VEGF表达来抑制肿瘤血管生成30。

同样，百里香醌是植物黑枯铭中发现的植物化合物，通过抑制细胞外信号调节的激酶信号通路抑制肿瘤血管形成和肿瘤生长31。

迄今为止，尽管抗血管形成的分子主要靶向作用于内皮细胞，并显示出有效控制肿瘤血管生成的能力；然而天然产物衍生的单一化合物尤其是通过调节干/祖细胞显著延迟肿瘤血管生成而控制肿瘤肿块的生物活性大多未知。

因此，本研究考察人参皂苷Rg3是否能否成为促进EPC抑制血管形成的分子靶向治疗，最终通过阻断VEGF-VEGFR2细胞内信号通路而抑制肿瘤脉管系统。

事实上，人参皂苷Rg3可通过体外减弱VEGF-p38轴的磷酸化级联反应而抑制VEGF依赖性的体外迁移能力和EPC的细胞增殖。

人参皂苷Rg3还可阻断血管生成的属性，包括体外管腔形成能力和体内血管形成（通过基质胶栓试验证明）。

另外，异种移植的鼠模型显示，人参皂苷Rg3可遏制BM衍生的EPC的动员，并抑制肿瘤血管生成，进而减弱Lewis肺癌（LLC）肿瘤的生长和肿瘤脉管系统的形成。

结果

人参皂苷Rg3对EPC细胞和LLC细胞存活率和凋亡的影响。

因为人参皂苷Rg3可影响EPC和LLC的细胞存活率，以时间或剂量相关效应进行人参皂苷Rg3的存活率试验。

如图S1A–C所示，人参皂苷Rg3处理组的细胞存活率和细胞数在72小时内尚未见显著差异。

在无血清培养基中通过核查细胞凋亡蛋白酶3（细胞凋亡的代表性指示剂）切割的表达进行细胞凋亡试验，以进一步阐明人参皂苷Rg3对EPC和LLC细胞生存的影响。

如图1E和图1F以及图S2A所示，我们观察到人参皂苷Rg3处理后细胞凋亡蛋白酶3的切割水平以时间和剂量相关性的效应显著增加，提示培育人参皂苷Rg3可大幅度地促进CB衍生的EPC和LLC细胞的程序性凋亡信号。

此外，我们采用FACS分析法分析这些凋亡细胞为钙磷脂结合蛋白V（+）/PI（-）细胞从而证明了这些研究结果。

如图S2B所示，人参皂苷Rg3导致凋亡细胞和死亡细胞数量明显增加。

人参皂苷Rg3对EPC细胞VEGFR2表达和细胞增殖的影响.首先通过RT-PCR、实时RT-PCR和Westernblot考察人参皂苷Rg3对VEGFR2表达的影响，进而考察人参皂苷Rg3对EPC抗增殖特性的影响（图2A和图2B；图S2B）。

Rg3以剂量相关性的效应导致VEGFR2mRNA和蛋白质的表达水平明显下降。

此外，在含有VEGF的情况下，以人参皂苷Rg3刺激之后评估增殖特性。

尤为明显的是，人参皂苷Rg3以剂量相关性效应抑制VEGF依赖性的细胞增殖（图3A）。

本研究观察VEGF依赖性的信号通路，以考察人参皂苷Rg3对EPC细胞增殖信号级联反应的效应。

采用p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38、p38、p-JNK和JNK的抗体，进行Westernblot分析。

采用β-肌动蛋白为蛋白质加样对照品。

如图3B和C所示，VEGF依赖性的ERK和p38信号的磷酸化明显下降，但JNK信号并未下降；与此同时，无VEGF刺激时人参皂苷Rg3处理组中无显著差异（图S4A）。

人参皂苷Rg3对细胞周期进程的影响.为了进一步确定人参皂苷Rg3是否作为影响EPC细胞周期进程中的关键蛋白，G1期中涉及的细胞周期信号分子通过Westernblot分析进一步评估。

如图4A和B和图S4B所示，人参皂苷Rg3在VEGF信号反应时深度抑制细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E和Cdk2的蓄积（而并非Cdk4），提示人参皂苷Rg3可以延缓G1期过程中细胞周期蛋白E和Cdk2的蓄积，可能影响VEGF依赖性的EPC增殖水平。

人参皂苷Rg3对VEGF诱导的迁移能力和EPC的管腔形成影响的生物活性.因为肿瘤血管形成过程中的细胞迁移特性是发生管腔形成的一种主要因素，也是新血管形成的关键过程；因此首先采用伤口愈合试验来考察人参皂苷Rg3对EPC迁移能力的的影响。

与预期相一致，VEGF处理的EPC促进受损细胞单层的修复（图5A和图S5A）。

特别是，人参皂苷Rg3剂量相关性地阻断EPC中VEGF诱导的伤口愈合能力，提示人参皂苷Rg3在血管修复过程中直接影响EPC的迁移能力（图5B）。

图1.人参皂苷Rg3对EPC细胞存活率和细胞凋亡的影响。

（A）人参皂苷Rg3的化学结构。

（B）快速增殖EC的内皮表型，来自于分离的脐带血MNC，并通过FACS分析证实，显示内皮标志物CD31、CD34、KDR、CXCR4、c-Kit、CD133的表达。

该图表示快速增殖EC的百分率。

（C和D）在含有人参皂苷Rg3的情况下，采用EPC和LLC确定细胞毒性效应。

在正常培养条件下培养24小时之后，采用WST-1试验分析总细胞数。

以高达600ng/mL的人参皂苷Rg3处理，并未明显改变细胞数，表明人参皂苷Rg3并不影响EPC和LLC的存活率。

（E和F）在含有人参皂苷Rg3的情况下，采用EPC和LLC确定细胞凋亡效应。

在无血清培养条件下培养24小时后，人参皂苷Rg3处理以剂量依赖性的方式增加细胞凋亡蛋白酶-3（一种细胞凋亡的典型指标）的切割量，如Westernblot分析所证明。

因为人参皂苷Rg3可影响EPC功能性管腔形成能力，在递增浓度的人参皂苷Rg3活化EPC后以开展管腔形成试验。

6小时之后，在EPC对照组中观察到毛细血管样管状结构显著增加。

另一方面，人参皂苷Rg3处理的EPC组则显示出EPC形成管腔的能力明显丧失（图6A），如分支和管长随机计数所证明。

提示，人参皂苷Rg3处理的EPC显示出明显的管腔形成功能缺陷（图6B和C）。

人参皂苷Rg3对肿瘤血管形成和肿瘤生长的影响.开展鼠源LLC肿瘤异种移植的实验，以证明人参皂苷Rg3是否在肿瘤进展中抑制EPC衍生的微血管（图7A）。

所有单纯溶媒处理的小鼠在处死时的肿瘤体积均较大，已达到227±24mm3。

将LLC细胞（5×104）与人参皂苷Rg3一起注射至小鼠侧面时，观察到肿瘤肿块的肿胀程度显著下降（103±58mm3）（图7B）。

因此，与注射溶媒组肿瘤相比较，人参皂苷Rg3能够降低肿瘤生长水平超过50%。

其次，考察溶媒组肿瘤和人参皂苷Rg3组肿瘤的毛细血管密度；如图7C所示，600μg/kg剂量的Rg3处理组较单纯溶媒注射组的荷LLC肿瘤小鼠显示出较低的血管生成。

经过每组动脉和毛细血管密度的验证，人参皂苷Rg3治疗组肿瘤组织中所检测的CD31阳性内皮细胞较低。

特别是，Rg3组动脉和毛细血管的数目明显降低（图7D和E）。

人参皂苷Rg3对EPC动员步骤的影响.为了考察人参皂苷Rg3对EPC动员动力学的影响，在荷LLC肿瘤小鼠每日经口给予人参皂苷Rg35天后开展流式细胞检测分析（图8A）。

采用同种型IgG阴性抗体在CD45（-）细胞的PB衍生单核细胞门控组分评估CD34（+）/VEGFR2（+）细胞的亚组分（图8B）。

循环型CD45（-）/CD34（+）/VEGFR2（+）细胞代表荷LLC肿瘤小鼠的一种过表达模式，但在单纯溶媒组表达较少。

如图8C所示，在肿瘤组和Rg3-处理的肿瘤组之间存在循环型CD45（-）/CD34（+）/VEGFR2（+）细胞数的显著差异，提示人参皂苷Rg3可能调节BM微环境，并在诱导小鼠LLC肿瘤之后调节EPC的数目或生物活性。

人参皂苷Rg3对VEGF诱导的新血管形成的影响.考虑到进入缺血组织的募集步骤和进入PB的BM动员步骤一般均通过VEGF信号启动，人参皂苷Rg3可控制VEGF诱导的肿瘤血管形成。

为检验这种假说，开展小鼠基质胶栓试验以考察人参皂苷Rg3对新血管形成的抑制作用。

如图9A所示，VEGF组可观察到暗红色栓塞，但人参皂苷Rg3和VEGF组可见红色栓塞显著下降，表明与VEGF处理的栓塞相比较，人参皂苷Rg3减少血管形成。

为进一步检验这种假说，通过代表性的内皮标志物CD31染色基质胶栓塞组织，以显示滤过和分化的内皮细胞。

如图9B和C及图S5B所示，VEGF和人参皂苷Rg3组栓塞中的CD31阳性内皮细胞的数目比单纯的VEGF组要低得多。

图2.人参皂苷Rg3对EPC中的VEGFR2表达的影响。

（A）Rg3处理的快速增殖EC中，VEGFR2的mRNA水平，通过RT-PCR分析证明。

（B）Rg3处理快速增殖的EC中的VEGFR2蛋白表达，通过Westernblot分析证明。

讨论

肿瘤进展过程中，主要由已存在的血管通过内皮细胞的增殖和迁移形成新血管，且似乎被缺氧的肿瘤中募集的BM衍生干/祖细胞所促进32，33。

尤为引人注意的是BM衍生的EPC，据报道它通过介导血管生成开关在早期肿瘤的生长和转移损伤中发挥关键作用7-9。

还提出将EPC作为一种肿瘤内皮的替代供应源，进而以分化内皮细胞的形式直接掺入新生脉管系统而在血管形成中发挥作用10，11。

因此，EPC生物活性的特异性靶点似乎是一种有效的抗血管生成治疗靶点，抗血管生成治疗无副作用7-9，34。

现有的数据显示，天然药物人参的主要生物学活性成分人参皂苷Rg3，靶向抑制EPC活性而抑制肿瘤生长和新血管形成。

基于以上结果，可以得出结论：

人参皂苷Rg3可有效抑制EPC的多重生物活性，包括对VEGF信号的细胞增殖反应、包括骨髓动员至外周血在内的迁移能力与促进管腔形成、以及对肿瘤血管形成和肿瘤生长的抑制作用，如体内异种移植鼠肿瘤模型所证实。

肿瘤进展过程中，VEGF信号密切参与肿瘤脉管系统的启动和肿瘤生长，在病理性的血管形成中发挥重要作用，最终导致肿瘤生长速率加快、侵袭和转移22，35。

重要的是，这些结果提示，人参皂苷Rg3通过抑制EPC的VEGF-VEGFR2信号级联反应抑制血管形成。

经过体外Westernblot证明，人参皂苷Rg3在RNA和蛋白水平降低EPC中的VEGFR2表达，并遏制VEGF依赖性的、细胞增殖信号之下的多重信号级联反应。

同样，体内基质胶栓试验表明Rg3可明显有效地抑制VEGF-诱导的血管形成。

除了人参皂苷Rg3对肿瘤进展过程中新生脉管系统的直接效应，这些结果还支持人参皂苷Rg3可能抑制BM衍生的EPC动员这一假说36。

由于肿瘤进展过程中精确控制祖细胞对抑制肿瘤生长和肿瘤脉管系统极为重要，经口给予人参皂苷Rg3显著降低外周祖细胞为肿瘤血管形成提供了一种明确的解释，包括体内异种移植鼠肿瘤模型实体瘤中肿瘤毛细血管生长的显著降低。

数据提示：

人参皂苷Rg3可抑制多种信号级联反应，包括VEGF依赖性的p38和ERK信号通路。

VEGF依赖性的ERK信号级联反应似乎与细胞增殖、生存和细胞迁移有关29。

至于EPC生物学，适当调节VEGF依赖性的ERK信号可能是遏制肿瘤血管形成的治疗靶点。

重要的是，这些结果提示，人参皂苷Rg3衰减VEGF依赖性p38信号的磷酸化级联反应，表明人参皂苷Rg3可影响多重VEGF介导的下游信号级联反应。

该数据通过分析包括细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白D1在内的细胞周期调节蛋白得到证明；因为Rg3可通过抑制细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白D1来抑制细胞周期进程。

有意义的是，分析VEGF依赖性的EPC细胞周期显示人参皂苷Rg3可抑制Cdk2的累积，而并非Cdk4。

先前的研究已报道：

细胞周期蛋白D/Cdk4/6轴可在其一组磷酸化的亚位点特异性磷酸化pRB，pRB的完全磷酸化需要细胞周期蛋白E-Cdk2特异性靶向作用于剩余的磷酸化位点37。

因此，人参皂苷Rg3抑制Cdk2导致细胞周期进程的G1期阻断这一发现，可能与人参皂苷Rg3处理的EPC中VRGF依赖性pRB磷酸化的第二个步骤的进展延迟密切相关38，39。

总之，本研究显示人参皂苷Rg3可抑制EPC的增殖、迁移、管腔形成并有效遏制VEGF依赖性的新血管的体内形成同时减弱EPC动员，延缓肿瘤进展和肿瘤血管形成。

这些结果提供了有力证据，证明人参皂苷Rg3是一种潜在的癌症备选化疗药物，可降低化学毒副作用（图1C和D）。

天然产物在直接遏制肿瘤血管中内皮细胞中和适当抑制促血管生成细胞活性方面均显示协同效应，这一发现将提供一种颇具前景的抑制肿瘤生长和新血管形成的途径。

今后应进一步开展实验以深入了解人参皂苷Rg3在各种肿瘤EPC生物学效应的分子机制，从而确定EPC生物活性在控制肿瘤血管形成、血管生成开关和肿瘤转移中的作用。

图3.人参皂苷Rg3对EPC增殖的影响。

（A）在含有VEGF且加或不加人参皂苷Rg3情况下处理24小时之后，开展细胞增殖试验；人参皂苷Rg3对VEGF诱导的快速增殖EC细胞增殖的影响。

**p<0.005（对照和VEGF之间差异显著）；*P＜0.05（VEGF和VEGF加人参皂苷Rg3之间差异显著）。

（B）人参皂苷Rg3可削弱ERK的磷酸化和p38的蛋白水平，而并非JNK，如使用过生长的EC通过Westernblot分析所证明。

总的ERK、JNK、p38和β-肌动蛋白作为一种荷蛋白对照被考察。

所有的数据来自于至少3个独立试验。

（C）图中代表每组相对于ERK、p38和JNK对照组的相对光密度。

条形图表示每组百分率，以未处理组为100%。

*p<0.05，**p<0.005。

材料与方法

药物.人参皂苷Rg3购自于BTGin有限公司（Okcheon）。

在DMSO（10mg/ml）中新鲜制备Rg3溶液。

图1A显示了人参皂苷Rg3的化学结构。

人快速增殖EC的分离和细胞培养.HUCB由釜山国立大学医院提供。

新鲜分离的MNC培养于补加5%胎牛血清（FBS）、促血管生长因子（10ng/mLbFGF，20ng/mLVEGF，10ng/mLIGF和10ng/mLEGF）和其它因子（诸如抗坏血酸、GA-1000）的内皮细胞培养基（EGM-2，Lonza）中。

培养4天之后，除去非粘附细胞，将紧密贴附的部分细胞再铺板并再培养3天，再通过新配的EGM-2培养基采用纺锤形集落继续培养长达14–21天。

其后，通过Dil-结合Ac-LDL（Dil-Ac-LDL）（生物医学技术公司）的摄取和FITC结合的异凝集素B4的化学结合（Sigma化学品公司，一种标准的内皮谱系细胞标志物）考察贴附的纺锤形细胞的内皮特性。

经荧光显微镜检查，EPC为双阳性的细胞（数据未列出）。

免疫组化显示，离体培养快速增殖的EC可表达几种内皮细胞谱系标志物，包括CD31、KDR/Flk-1以及几种祖细胞表面标志物[包括CD34、c-kit和CD133以及一种关键功能性的标志物CXCR4，即SDF-1的受体，参与缺血部位快速增殖的EPC归巢（图1B）。

细胞毒性检测.为了确定人参皂苷Rg3对离体培养快速增殖EC的细胞毒性，将细胞接种（1×104细胞/孔）于凝胶包被的96孔培养板中，加入5%胎牛血清（FBS）、促血管生长因子的EGM-2培养基。

在24、48和72小时，人参皂苷Rg3的加样浓度为60~600ng/mL。

通过加入10μl/孔的WST-1（Ez-细胞毒性细胞存活率测试盒），评价细胞毒性。

4小时之后，采用微孔板读数器（TECAN，Sunrise）测量540nm处的光密度。

增殖试验.离体培养快速增殖EC（1×104细胞/孔）置于涂布凝胶的96孔培养板中。

24小时之后，将细胞在补加0.1%FBS的EBM-2培养基中饥饿血清24小时。

其后在含有100ng/mLVEGF的情况下用各种浓度人参皂苷Rg3培养48小时。

采用WST-1试验（Ez-细胞毒性细胞存活率测试盒）分析活细胞。

伤口愈合试验.以EBM-2培养基或含有0.1%FBS的DMEM饥饿离体培养快速增殖的EC（1.5×105细胞/孔）和LLC共24小时。

伤口愈合试验以微量吸液器头划伤24孔板中的单层细胞生长物。

洗涤细胞以除去碎片，在含有不同浓度的人参皂苷Rg3和100ng/mLVEGF的低血清培养基中培养8小时，再采用光学显微镜观察。

管腔形成试验.离体培养快速增殖的EC（2×104细胞/孔）和LLC（2×104细胞/孔）接种于每孔包被55μl基质胶基质（BD，10ml小瓶）的96孔培养板中，37℃包被30分钟。

培养6小时后检查培养板中的管腔形成情况。

培养后，确定管腔形成水平，其后每孔在40×放大倍数下随机拍摄一张光学显微镜相片。

采用imageJ软件（http:

//rsb.info.nih.gov）测量管长。

流式细胞术分析.为了核查Rg3处理的LLC荷瘤小鼠中的EPC数，采用特异性抗CD45、CD34和Flk-1的几种单克隆抗体进行流式细胞术分析。

简言之，以直接标记的异藻蓝蛋白（APC）结合的抗小鼠CD45（BDPharMingen）、异硫氰酸荧光素（FITC）结合的抗小鼠CD34（BDPharMingen）和藻红蛋白（PE）结合的抗小鼠Flk-1（BDPharMingen）抗体冰下培养新鲜分离的MNC共30分钟。

此外，为了核查人参皂苷Rg3处理组的凋亡细胞数，采用钙磷脂结合蛋白V/PI系统（BDPharMingen）进行流式细胞术分析。

2%多聚甲醛固定免疫荧光标记的细胞，由FACS流式细胞术（BectonDickinson）和细胞Quest软件进行分析，每个样品计数10000。

图4.人参皂苷Rg3对EPC细胞周期进程的影响。

（A）采用抗关键细胞周期分子的多重抗体，使用Westernblot技术分析细胞周期进程。

（B）图中代表每组相对于β-肌动蛋白对照组的相对光密度。

条形图表示每组百分率，以未处理组为100%。

*p<0.05，**p<0.005。

图5.人参皂苷Rg3对EPC迁移能力的影响。

（A）代表性光学显微照片显示细胞单层的伤口愈合作用。

Rg3对VEGF诱导的快速增殖EC迁移的抑制作用。

对离体培养快速增殖的EC进行伤口愈合迁移试验。

误差条，500μm。

（B）条形图代表迁移的细胞数。

从各种切片水平随机选择视野，以确保采样的客观性。

*对照和VEGF之间显著性，p<0.05，VEGF和VEGF加人参皂苷Rg3之间显著性，p<0.05。

图6.人参皂苷Rg3对EPC管腔形成能力的影响。

（A）快速增殖EC在有或无人参皂苷Rg3时的代表性管形网络结构。

误差条，500μm。

（B和C）Rg3处理快速增殖的EC和溶媒处理快速增殖的EC之间的差异显著。

条形图代表经过imageJ软件测量毛细血管网中完整环圈的数目。

图代表毛细血管网络中的管长（*p<0.05，**p<0.005）。

逆转录（RT）-PCR.按照厂商的建议采用TRIZOL试剂（TaKaRa）从EPC中分离出总RNA。

按照先前在参考文献40中详细描述的方法进行RT-PCR。

扩增人VEGFR2mRNA的引物对序列如下：

5'-GTGACCAACATGGAGTCGTG-3'和5'-TGCTTCACAGAAGACCATGC-3'。

首先将样品在94℃变性5分钟并扩增30个循环（94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒）并在72℃末端扩展5分钟。

1%琼脂糖凝胶电泳PCR产物。

RT