微工实验报告.docx

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微工实验报告

中国海洋大学实验报告

实验一培养基的配置和灭菌

一、目的要求

1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配置过程。

2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。

二、实验材料

1.药品：

酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4·7H2O、1NHCl、1NNaOH

2.设备：

高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。

3.材料：

天平、药匙、电炉、pH试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签等。

移液器（1mL0.2mL）。

三、实验内容

（一）培养基的配制

1.培养基的配制方法和步骤

1）称量：

按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。

2）溶化：

在烧杯中加入所需水量，玻璃棒搅匀，加热溶解。

3）调pH值：

用1NNaOH或1NHCl调pH，用pH试纸对照。

4）加琼脂溶化：

加热过程要不断搅拌，可适当补水。

5）分装：

注意不要污染试管塞或纱布。

6）包扎成捆：

用记号笔注明何种培养基。

7）灭菌：

在高压锅中，115℃高温灭菌30min。

2.培养基的配制

A.富集培养基（液体）：

海水2216E液体培养基（g/L）：

蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH8.0。

取50m分装250mL三角瓶后，8层纱布封口，外包一层牛皮纸，121℃高温灭菌20min。

B.2216E斜面（固体）：

海水2216E液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。

C.无菌生理盐水和保种液：

生理盐水：

NaCl0.85%蒸馏水配制。

每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121℃高温灭菌20min。

保种液：

生理盐水，加25%甘油。

D.碳源优化培养基：

以海水2216E液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：

葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。

（二）分离培养微生物常用器皿的准备

1）清洗一些玻璃仪器：

如三角烧瓶、试管、培养皿等。

2）制作8层纱布，酒精棉。

3）Tip头（0.2,1mL，分装枪头盒，牛皮纸包好，灭菌）；保种管；药匙；长竹签。

4）卫生（308实验室超净台，实验台面）

（三）培养基和玻璃器皿的灭菌方法

1.加压蒸汽灭菌法。

其步骤如下：

1）灭菌锅内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。

2）接通电源，进行加热。

3）排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排除冷空气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力恢复到将近零时，再关闭排气阀。

4）当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌锅内的温度为121℃，维持30min。

对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。

5）灭菌时间一到，切断电源。

待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌锅盖，取出物品。

2.紫外线灭菌

一般使用30W灯管，9m2空间，距地面2m，打开紫外灯照射0.5h，可使室内空气灭菌。

若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。

紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此适用于空气表面杀菌。

3.化学药剂消毒灭菌

微生物实验室中常用的化学杀菌剂有酒精、甲醛、高锰酸钾、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、来苏尔、过氧乙酸等，它们有的是杀菌剂，有的是抑制剂。

四、思考题

1.固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？

答：

（1）加热器功率不能太高，也不能太低。

太高，容易沸腾和把培养基烧焦；太低，培养基容易凝固。

（2）受热要均匀，可以垫上石棉网，要用玻璃棒不停缓慢搅拌。

（3）加热完毕后，要在合适的温度（60℃左右）倒平板，防止凝固。

2.培养基中加琼脂的作用是什么？

答：

培养基中加琼脂的作用是：

1．用作凝固剂。

琼脂是多糖类物质，性质较稳定，一般稳定后不易分解，所以一般用作凝固剂而不引起化学成分的变化；

2．具有支持作用。

琼脂冷却后是固体，可用于配置所需的固体培养基，作用类似于支架。

3．用琼脂配制的固体培养基，可用以进行高温培养而不熔化，在凝固之前接种时，也不致将培养物烫死。

3.如何检查培养基灭菌是否彻底？

答：

把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管（瓶），标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。

如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。

经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。

实验二产碱性蛋白酶海洋细菌的分离筛选

一、目的要求

根据一定的实验目的如酶类的生产，建立合适、精确的筛选模型，并从特定的样品如海泥中筛选出高产菌株。

目的：

加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。

二、实验材料

1.仪器设备：

灭菌锅，培养箱，摇床

玻璃仪器（每组需用量）（已准备）

2.需准备的培养基

A.富集培养基（液体）：

海水2216E液体培养基（g/L）：

蛋白胨5.0，酵母粉1.0，陈海水1L，pH7.6。

取50mL分装250mL三角瓶后，8层纱布封口，外包1层牛皮纸，115℃高温灭菌30min。

B.2216E斜面（固体）：

海水2216E液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内加入5mL，115℃高温灭菌30min，灭菌后摆斜面。

C.无菌生理盐水：

NaCl0.85%去离子水配制

每支试管加入4.5mL，盖上试管帽、包扎、115℃高温灭菌30min。

D.碱性蛋白酶筛选培养基：

海水2216E-脱脂奶粉平板：

A：

4%脱脂奶粉，蒸馏水；B：

海水2216E液体培养基中加4%琼脂粉，pH10.0.A和B115℃高温灭菌30min后稍冷却，将A在无菌超净台中倒入B中，摇匀后倒入无菌平板。

（B瓶要大）

三、实验内容

3.1样品富集

取少量海泥样品加入富集培养基中，25℃,150rpm振荡培养24小时。

3.2稀释涂平板

摇匀富集后的富集培养基，用无菌生理盐水作梯度稀释（注意：

在管上做好标记），至10-4、10-5后各涂一个筛选平板，在28℃培养24小时。

3.3产蛋白酶菌株的筛选

观察筛选平板上所产生的水解圈，拍照。

每组选取1株水解圈大而明显的菌株，接在斜面上培养。

四、思考题

1.分析本实验中富集培养的原理。

答：

试验用海水2216E培养基中含有蛋白胨成分，产碱性蛋白酶海洋细菌可以迅速分解蛋白胨，快速增殖。

而其他细菌生长会低于产碱性蛋白酶海洋细菌，从而达到对产碱性蛋白酶海洋细菌富集的效果。

2.筛选平板上的透明圈是否能准确表示蛋白酶活的大小？

答：

不能。

透明圈是细菌代谢分解产生的现象，透明圈与细菌的数目，代谢速度，蛋白酶活性大小等密切相关，仅从筛选平板上的透明圈并不能准确表示蛋白酶活性的大小。

一般筛选透明圈与菌株的大小比例最大的菌株.

实验三微生物接种和菌种保藏

一、目的要求

1.了解并掌握微生物接种和菌种保藏的常用方法及其优缺点。

2.学习-80℃甘油保藏方法。

二、实验材料

1.菌种：

实验二中分离得到的海洋细菌。

2.培养基：

海水2216E培养基。

3.试剂：

陈海水、甘油、NaCl、无菌水。

4.材料：

无菌试管、无菌吸管（1mL及5mL）、无菌保种管、接种环。

三、实验内容

（一）斜面传代保藏法

1.贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。

2.斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上。

3.培养海洋细菌28℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。

4.保藏斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。

海洋细菌16℃生化培养箱保存。

管口应用牛皮纸或保鲜袋包扎。

（二）-80℃甘油保藏法

将筛选后的菌株（筛选平面上）接种于2216E斜面上，28℃培养12～18h，用无菌保种液洗下（用到振荡器、无菌操作），移液器加入保种管，写好标记，保存于-80℃超低温冰箱。

四、思考题

1.讨论各种菌种保藏方法的优缺点。

1）普通冷冻保藏法

优点：

保藏的菌种范围广；实验条件容易得到满足。

保藏时间较短一般为1--2年。

缺点：

低温只能一直微生物的生命活动，而不是使其休眠，因而保藏时都会带有一定的水分，所以保藏时间不宜太长；避免停电等事故，防止保藏过程中的意外发生；经次解冻的菌株不宜二次保藏；保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封；不适宜多数微生物的长期保藏。

2）液氮冷冻保藏法

优点：

保藏的质量高；保存的时间长，一般为10年左右。

缺点：

实验条件所需的费用高。

3）冷冻干燥保藏法

优点：

本法适用于多种放线菌、细菌，多数情况下也适用于病毒、噬菌体、立克次氏体、真菌和酵母等微生物；可用此法保藏的菌株范围广。

保藏期限在10年以上。

缺点：

霉菌菌丝、大多数藻类、原虫及病原菌不宜用此法保藏；在真空干燥的过程中可能引起DNA断裂的缺点，因而对生产菌种不太理想。

冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，如脱脂乳和蔗糖，冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。

4）矿物油浸没保藏法

优点：

将琼脂斜面或液体培养菌种物浸入无菌矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。

本法不需要特殊的设备，可延长移植间隔时间，一般可达1--3年，少数微生物每隔六个月移植一次。

缺点：

本法不适合固氮菌、乳酸杆菌、分歧杆菌、沙门菌、毛霉、根霉等菌；容易变异。

工业上高产菌株一般也很少用此种方法。

5）传代保藏法（定期移植保藏法）

优点：

此法简单和经济，可用于实验室中若干菌种的保藏及某些特殊菌体的保藏例如：

霍乱菌，脑膜炎球菌等；方法简单；保藏时间为1--3个月。

缺点：

容易发生遗传变异；连续传代后一些有利性状如所要求的病原性、代谢产物的生产能力、产孢子能力等减弱；容易造成杂菌污染；培养基组分及培养温度的细微变化可能导致丧失贵重菌株；易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变，应加以防治。

不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。

6）沙土保藏法

优点：

本法适用于产芽孢或孢子的细菌、放线菌和真菌的保藏；本法操作简便。

易于掌握，青霉素及其他霉素菌不少菌种用此方法保藏，可存活5-7年。

缺点：

存活率低，变异率高。

特别是抗生素工业上的高产菌株采用本法保藏时对高产特性的保藏效果差，仅在真空干燥这一步，不少军菌的死亡率即达90%以上。

另外，在真空后容易引起DNA断裂致使菌体发生变异。

7）液体石蜡保藏法

优点：

此法实用而效果好。

霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。

此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。

缺点：

保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。

从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

8）-80℃甘油保藏法

优点：

该方法适合于中长期菌种保藏，保藏时间一般为2—4年左右。

保藏过程中培养基的理化性质稳定，菌种不容易发生变异，且微生物的性状比较稳定，不容易污染杂菌。

缺点：

是无法随时检查保藏菌株的生长代谢状况，只能进行中、长期保藏。

实验四菌种的紫外诱变筛选

一、目的要求

1.学习菌种的诱变育种基本技术。

2.通过诱变技术筛选出高产蛋白酶的菌种。

二、实验原理

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变异。

在生产和科研中可利用此法获得突变株。

紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20～30cm，照射时间依菌种而异，一般为1～3min，死亡率控制在50%～80%为宜。

被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。

同时，对于细菌细胞的生理状态，要求培养至对数生长期为最好。

本实验以紫外线处理产蛋白酶的海洋细菌，通过透明圈法初筛，选择蛋白酶活力高的菌株。

三、实验材料

1.菌种实验而筛选得到的产蛋白酶菌株。

2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10ml离心管、（1、5、10ml）吸管、250ml三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。

3.培养基和试剂

1）无菌生理盐水、75%酒精

2）筛选培养基：

脱脂奶粉培养基

3）海水2216E液体培养基

四、实验步骤

（一）出发菌株菌悬液的制备

1.出发菌株移接到新鲜斜面培养基，25℃培养16～24h；

2.将活化后的菌株接种于液体2216E培养基，25℃150rpm振荡培养过夜（约12h）；

3.取1ml于1.5ml离心管中，10000rpm离心5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，制成菌悬液；

4.将上述菌悬液倒入含转子的培养皿中，再倒入9ml无菌生理盐水。

（二）UV诱变

1.将紫外灯打开，预热30min；

2.将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止一分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，处理60s，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；

3.将诱变菌液在黑暗中培养2～3min，后分别取50μl和0.1ml涂布培养。

五、思考题

1.试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。

答：

答：

（一）紫外线诱变的作用机理：

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，波长在200-380nm之间，但其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体阻碍碱基间的正常配对，从而形成突变型。

在生产和科研中可利用此法获得突变株。

紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。

（二）操作中应注意的问题：

1）细菌细胞的生理状态，要求培养至对数生长期为最好；

2）在使用紫外灯之前要先开30min进行预热，使其达到稳定状态；

3）紫外照射后，在黑暗中保持一段时间，从而避免光复活；

4）被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现；

5）操作过程中注意避免皮肤等被紫外线照射到，尤其防止紫外线对眼，脸部位的辐射损伤；

6）诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行；

7）注意控制照射的时间和强度。

否则紫外线会杀死细胞或者微生物，达不到诱变的效果。

2.为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？

答：

把菌悬液打散是为了使菌种分散，与培养液充分混合，有利于菌种复苏生长，进入对数生长期；另外也使菌液均质，有利于紫外光的均匀分布处理，让菌株均匀的接触紫外诱变，提高诱变的效率，并可减少不纯种的出现；培养一段时间可提高菌株的数量，使其达到对数生长期，这样诱变成功的几率才会变大，因为细胞发生突变的概率很小。

3、你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？

答：

以上的筛选方法主要是从产物的角度出发进行筛选。

优点：

简单快速。

初筛主要是从量的角度筛选，复筛主要是从质的角度筛选，二者配合可大幅提高筛选的效率。

缺点：

因为培养条件的差别，有时会造成初筛与复筛的结果不一致。

改进措施：

在筛选过程中：

1）首先进行初筛的菌株可以选择多株菌种进行复筛，并进行平行实验，为复筛准备；

2）复筛过程中，对于所选择的多株菌株同时再次筛选，并对比观察，挑选出最为优质的菌株作为目的菌，同时进行多次平行实验，从而对比选择出最优菌株。

蛋白酶活性的测定

采用FoLin酚法（周德庆，1986）

1mL酶液（上清液）与1mL2％（w/v）的酪蛋白（底物）30min,在上述条件下每分钟释放1μg的酪氨酸所需的酶量为一个单位（U）。

实验步骤：

1．发酵液摇匀，取1mL加入EP管，4℃12000rpm离心10min，得到发酵上清液。

2．测定组：

取0.4mL酶液（上清液）与0.4mL2％（w/v）酪蛋白溶液，预热5min，

混合后，40℃反应30min，加入0.6mL20％（w/v）TCA终止反应，12000rpm离心10min，取上清液。

3．对照组：

0.4mL酶液，先加入0.6mL20%（w/v）TCA，再加入0.4mL2%（w/v）酪蛋白溶液，40℃条件下反应30min，12000rpm离心，取上清。

4．3只大试管，每管分别加入1mL测定组上清液，1mL对照组，1mL蒸馏水，每管加入0.55molNa2CO35.0mL，混匀后，加入FoLin-酚试剂1mL，立即混匀，30℃条件下显色15min,以加蒸馏水为空白,650nm测OD值。

酶活单位：

（OD样—OD对照）•K•v/t•N（酪氨酸µg/0.5mL）

=（0.713-0.705）x114.7x1.4/（30x1）

=0.042

实验五单因子实验方法进行碳源优化

一、目的要求

掌握微生物发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。

目的：

筛选微生物最适生长及产物形成的营养条件和培养条件，确定特定产物发酵的工艺参数。

二、实验材料

1.仪器设备分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。

2.玻璃仪器250ml三角瓶6个，500ml烧杯1个，100ml量筒1个，1mlTip头1盒。

3.需准备培养基（实验一）。

三、实验内容

（一）培养基的配制

以海水2216E液体培养基（g/L：

蛋白胨5.0，酵母粉1.0，磷酸铁0.01，pH调至7.6-7.8）为基础，碳源分别是：

葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。

（二）测定方法

在种子瓶内接入1环斜面培养基上培养的细胞，28℃，160r/min振荡培养12h作为种子液，将该种子培养液按2%（v/v）接种量（1mL）接种到含50mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中再次进行摇瓶发酵，摇床转速160r/min，28℃发酵培养24h，取培养液测细胞干重。

细胞干重测定：

取1.5mL离心管，首先称重M0，然后将发酵液摇匀，移液器取1mL加入离心管，8000rpm离心5min，小心吸出上清液，保留细胞沉淀，最后将离心管开口放入烘箱中烘干至恒重，再次称重M，计算差值M-M0。

以细胞干重值为纵坐标，各种碳源为横坐标作图，比较不同碳源对细胞生长的影响，确定最佳碳源。

四、思考题

1.对实验结果进行分析，讨论不同碳源对菌株生长的影响。

由上图可知，细胞生长的最佳碳源为海水，其次是甘油、柠檬酸钠。

此结果与之前的预期不符合，实验的误差可能是称量有误。

2.结合已学过的微生物工程理论课，讨论单因子实验方法的优缺点。

答：

单因子实验是指假设因素间不存在交互作用的前提下，一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考虑的优化方法。

由于简单方便，一直都是培养基组分优化的最流行选择之一。

其优点为：

操作起来简单容易；培养基组分的个体效应从图表上很明显的看出来而不需要统计分析；缺点为：

①忽略了组分间的交互作用，可能会丢失最适宜的条件；②不能考虑因素的主次关系；③当考虑的实验因素较多时，需要进行大量的实验和较长的周期。