免疫细胞的分离及表面标志检测技术免疫细胞功能.docx

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免疫细胞的分离及表面标志检测技术免疫细胞功能

第十四章免疫细胞的分离及表面标志检测技术

第十五章免疫细胞功能检测技术

SeparationandAssaysforImmunocyte

第一部分目的要求和教学内容

一、目的要求

掌握：

Ficoll—hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、

方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测，NK细胞的活性、中

性粒细胞、巨噬细胞功能的检测方法；熟悉：

T细胞功能的体内试验、T细胞介导的细胞

毒检测的方法；了解：

淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空

斑试验。

二、教学内容

1．免疫细胞的分离与纯化：

细胞的分离，外周血单个核细胞的分离，淋巴细胞的纯

化与亚群分离，吞噬细胞的分离。

2．淋巴细胞的数量检测：

T细胞数量检测，B细胞数量检测。

3．淋巴细胞的功能检测：

T细胞功能检测，B细胞功能检测，NK细胞活性测定。

4．吞噬细胞功能检测：

中性粒细胞功能检测，巨噬细胞功能检测。

第二部分测试题

一、选择题

（一）单项选择题（A型题）

1．外周血中的单个核细胞主要是指

A．淋巴细胞

B．嗜酸粒细胞

C．单核细胞一淋巴细胞

D．单核细胞

E．中性粒细胞

2．分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为

A．1.030

B．1.035

C．1.092

D．1.020

E．1.077

3．用FicolI—hypaque分层液分离PBMC,分离的PBMC层位于试管的

A．血浆层之上

B．血浆层之中

C．血浆层与分层液之间

D．分层液之中

E．试管底部

4．用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主

要是

A．粒细胞

B．淋巴细胞

C．单核细胞

D．T细胞

E．B细胞

5．能与SRBC占合形成E花环的细胞主要是

A．T细胞

B．B细胞

C．单核细胞

D．粒细胞

E．血小板

6．用小鼠抗人CD3单克隆抗体检测T细胞，其结果代表的是

A．T细胞总数

B．Th胞数

C．Ts细胞数

D．CD4＋细胞数

E．CD8＋胞数

7．用尼龙棉柱分离细胞时，不易黏附尼龙棉纤维而被洗脱的细胞是

A．粒细胞

B．B细胞

C．单核细胞

D．T细胞

E．血小板

8．表示淋巴细胞的活力常用

A．活淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比

B．活细胞浓度

C．淋巴细胞浓度

D．活细胞和总细胞的比值

E．T细胞和B细胞的比例

9．用腹腔渗出法可从动物的腹腔渗出液中分离出

A．血小板

B．B细胞

C．单核细胞

D．T细胞

E．巨噬细胞

10．活细胞经台盼蓝染色后呈

A．蓝色

B．棕色

C．红色

D．不着色

E．天青色

11．荧光标记法计数外周血B淋巴细胞，检测的特有的表面标志是

A．CDl9

B．CD20

C．补体受体

D．SmIg

E．FcR

12．NK细胞特有的表面抗原是

A．CD2

B．CDl6

C．无特异的表面抗原

D．CD23

E．CD56

13．仅能使T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是

A．PHA

B．PWM

C．．LPS

D．ConA

E．EBV

14．能使B细胞和T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是

A．PHA

B．PWM

C．．LPS

D．SPA

E．EBV

15．检查体液免疫功能最常用的方法是

A．血清免疫球蛋白定量测定

B．溶血空斑试验

C．B淋巴细胞计数

D．淋巴母细胞转化试验

E．SmlgG测定

16．溶血空斑试验用于检测下列何种细胞的功能

A．T细胞

B．B细胞

C．中性粒细胞

D．吞噬细胞

E．NK细胞

17．测定T淋巴细胞功能的体内试验是

A．锡克试验

B．狄克试验

C．结核菌素试验

D．天然血型抗体滴度

E．血清：

IgG测定

18．正常人外周血T淋巴细胞转化率为

A．<40％

B．40％～50％

C．60％～80％

D．80％

E．>90％

19．常用检测细胞毒效应的方法是

A．3H-TdR掺人法

B．125I释放法

C．51Cr释放法

D．形态学检测法

E．CD8检测法

20．包被有抗Ig抗体的亲和板，其吸附的是

A．T细胞

B．B细胞

C．NK细胞

D．NKT‘细胞

E．吞噬细胞

21．Ficoll—hypaque液分离淋巴细胞是一种

A．不连续密度梯度离心法

B．连续密度梯度离心法

C．亲和层析法

D．离子交换层析法

E．自然沉降法

22．Ficoll—hypaque淋巴细胞分离液的主要成分是

A．聚蔗糖

B．泛影葡胺

C．聚乙二醇

D．聚蔗糖+泛影葡胺

E．聚蔗糖+聚乙二醇

23．Percoll分离液的主要成分是

A．聚蔗糖

B．泛影葡胺

C．聚乙二醇

D．聚乙烯吡咯烷酮

E．经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒

24．检测中性粒细胞杀菌功能的方法是

A．NBT还原试验

B．白细胞计数

C．溶血空斑试验

D．淋巴母细胞转化试验

E．补体介导的细胞毒试验

25．MTT比色法检测IL-2活性，下列哪项是错误的

A．需要IL一2依赖细胞株

B．增殖细胞具有吸收MTT的能力

C．颜色的深浅代表细胞代谢活性的强弱

D．可反映B细胞的功能

E．可反映T细胞的功能

（二）多项选择题（x型题）

1．淋巴细胞分离液要求符合的条件有

A．对细胞无毒

B．高渗

C．不溶于血液

D．无色

E．有合适的比重

2．与T细胞计数有关的表面抗原是

A．CD2

B．CD3

C．CD4

D．CD8

E．CDl9

3．与B细胞计数有关的表面标志是

A．SmIg

B．CDl9

C．CD20

D．CD21

E．CD2

4．符合淋巴母细胞转化的形态学特征有

A．细胞体积变小

B．核仁明显、核染质疏松

C．可见有丝分裂

D．胞浆极少，呈天青色

E．胞内可见空泡

5．用酶联免疫斑点试验检测B细胞功能的优点有

A．稳定、特异B．可检测抗体分泌细胞

C．可检测抗体的分泌量D．可同时进行B细胞计数

E．可同时检测不同抗原诱导的不同抗体的分泌

6．细胞免疫功能测定包括以下哪些

A．T细胞计数

B．B细胞计数

C．T细胞功能测定

D．Tc细胞效应测定

E．细胞因子测定

7．检测淋巴细胞亚群常用的方法有

A．免疫荧光法

B．流式细胞仪测定

C．酶免疫组化法

D．放射免疫法

E．免疫金染色法

8．细胞免疫功能体内试验方法有

A．细胞毒试验

B．混合淋巴细胞反应

C．皮肤试验

D．淋巴细胞增殖试验

E．接触性过敏试验

9．T细胞增殖试验常用的检测方法有

A．流式细胞仪法

B．形态学方法

C．51Cr释放法

D．MTT检测法

E．3H一FdR掺人法

10．检测吞噬细胞功能的方法有

A．吞噬试验

B．杀菌试验

C．NBT还原试验

D．化学发光测定法

E．趋化功能测定法

11．淋巴细胞亚群的分离方法有

A．E花环分离法

B．尼龙棉柱分离法

c．亲和板结合分离法

D．免疫磁珠分离法

E．超速离心分离法

12．T细胞数量检测包括

A.T细胞增殖试验

B．间接荧光免疫法

C．酶免疫组织化学法

D．微量细胞毒试验

E．花环技术

13．检测T细胞数量的花环试验有

A．酵母菌花环试验

B．补体C3b花环试验

C．E花环试验

D．葡萄球菌花环法

E．抗体致敏细胞花环法

14．B细胞表面具有、

A．mIg

B．CD抗原

C．Fc受体

D．补体受体

E．EB病毒受体

15．B细胞数量检测的方法包括

A．mIg的检测法

B．CD抗原检测法

C．Fc受体检测法

D．补体受体检测法

E．小鼠红细胞受体检测法

16．B淋巴细胞功能的测定方法有

A．B细胞增殖试验

B．溶血空斑试验

C．酶联免疫斑点法

D．体内测定法

E．形态学检查法

17．中性粒细胞吞噬和杀菌功能的测定方法

A．形态学检查法

B．显微镜检查法

C．溶菌法

D．NBT还原试验

E．化学发光测定法

18．巨噬细胞功能的检测方法包括

A．炭粒廓清试验

B．吞噬功能检测

C．巨噬细胞溶酶体酶测定

D．细胞毒作用测定

E．巨噬细胞促凝血活性测定

（三）配伍题

问题1-3

A．红细胞层

B．粒细胞层

C．单个核细胞层

D．血浆与血小板层

E．淋巴细胞分离液层

1.采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，最上层是

2.采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，最下层是

3.采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，第二层是

问题4-6

A．淋巴细胞转化试验

B．溶血空斑试验

C．炭粒廓清试验

D．琼脂糖凝胶平板法

E．化学发光测定法

4．巨噬细胞吞噬功能的检测：

5．中性粒细胞趋化功能的检测：

6．中性粒细胞吞噬和杀菌功能的检测：

二、填空题

1．PBMC包括（）和（）。

2．在反相溶血空斑试验中，每一个空斑代表一个（）。

3．B细胞表面特异的标志是（）。

4．常用的测定淋巴细胞活力的方法是（）。

5．淋巴细胞转化情况的判定方法有（）、（）和（）。

6．淋巴细胞转化试验应用的同位素是（），细胞毒试验应用的同位素是（）

7．分离外周血白细胞常用的方法是（）和（）。

8．去除白细胞悬液中残留红细胞的常用方法有（）和（）。

9．去除单个核细胞悬液中单核细胞的常用方法有（）和（）。

10．检测T细胞数量的花环技术包括（）（）和（）；检测B细胞数量的花环技术主要有（）和（）。

11.淋巴细胞和单核细胞的密度为（）。

12．外周血经Ficoll分离液离心后从上到下分为（）（）及（）层。

三名词解释

1．外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）

2．E花环试验（erythrocyterosettetest）

3．淋巴母细胞转化试验（1ymphoblasttransformationassay）

4．溶血空斑试验hemolyticplaqueassay）

5．四唑氮蓝还原试验（nitrobluetetrazoliumrecoveryassay，NBT还原试验）

四、简答题

1．简述T淋巴细胞转化的试验原理和镜下淋巴细胞转化形态学特征。

2．叙述T细胞介导的细胞毒试验的原理、意义和方法分类

3．测定吞噬细胞功能有哪些常用方法?

五．论述题

简述Fic011一hypaque分离液分离PBMC的原理、步骤和注意事项。

第三部分参考答案与题解

一、选择题

（一）单项选择题（A型题）

1．C2．E3．C4．B5．A6．A7．D8．A9．E10·D

11．D12．C13．A14．B15．A16．B17．C18．C19．C20·B

21．A22．D23．E24．A25．D

（二）多项选择题（X型题）

1．ACDE2．ABCD3．ABCD4．BCE5．ABCDE6．ACDE

7．ABCE8．CE9．BDE10．ABCDE11．ABCD12．BCDE

13．CDE14．ABCDE15．ABCDE16．ABCD17．BCDE18．ABCDE

（三）配伍题

1.D2.A3.C4.C5.D6.E

二、填空题

1．淋巴细胞单核细胞

2．分泌Ig的细胞

3．SmIg

4．台盼蓝染色法

5．形态学方法。

H—TdR掺入法MTI"检测法

6．3H，51Cr

7．自然沉降法聚合物加速沉降法

8．无菌蒸馏水低渗裂解法0．83％氯化铵处理法

9．黏附去除法，羰基铁粉吞噬去除法

10．E花环试验葡萄球菌花环法抗体致敏红细胞花环法EA花环试验EAC花

环试验

11.淋巴细胞和单核细胞的密度为1.077+0.001。

12．外周血经Ficoll分离液离心后从上到下分为_血清_，_PBMC及_粒细胞、红细胞_层。

三、名词解释

1．PBMC：

外周血单个核细胞主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的

细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。

2．E花环试验：

T细胞表面有特异性绵羊红细胞（SRBC）受体，即E受体。

将T细

胞与SRBc按一定比例混匀，置4h至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与SRBC结合

形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的花环样结构，镜检计数可得总花环（Et）形成

率，亦即T细胞的百分率。

3．淋巴母细胞转化试验：

细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞出现一

系列的增殖反应，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，并发生形态返祖变化，如细胞

变大、胞质增多、胞质出现空泡、核染色质疏松、核仁明显，这种淋巴细胞增殖反应又称

淋巴细胞母细胞转化（1ymphoblasttransformation）。

4．溶血空斑试验：

该方法用于检测实验动物抗体形成细胞数目。

其基本原理是抗体

形成细胞分泌的Ig与SRBc上的抗原结合，在补体作用下出现溶血反应。

方法是将SRBC

与其免疫的小鼠脾细胞、补体及适量琼脂糖液混合倾注平板，或者将吸附有已知抗原的

SRBc与待检B细胞、补体及适量琼脂糖液混合倾注平板，温育一定时间，抗体形成细胞

释放的抗体会使周围SRBc致敏，并在补体作用下出现肉眼可见的溶血空斑，每一空斑中

央含有一个抗体形成细胞，因此空斑数量即代表抗体形成细胞数。

5．NBT还原试验：

活化的中性粒细胞与NBT一起温育，由于中性粒细胞吞噬杀菌过

程中产生超氧阴离子（O2-），使被吞进细胞内的NBT由原来呈淡黄色还原成不溶性的蓝

黑色颗粒，沉积在细胞浆中，称为NBT阳性细胞。

光学显微镜下计数NBT阳性细胞，其

百分率可反映中性粒细胞的杀菌功能。

四、简答题

1．T淋巴细胞转化试验原理：

T淋巴细胞在受到非特异性有丝分裂原或特异性抗原

刺激后能发生增殖反应，细胞代谢旺盛，蛋白质和核酸合成增加；与此同时细胞体积增大，分裂呈母细胞样，此为淋巴细胞转化现象。

因此可借助形态学方法观测淋巴细胞形态变化情况，3H一胸腺嘧啶核苷（3H—FdR）掺入法测定DNA合成情况，或MTT比色法测定线粒体代谢活性即可判定淋巴细胞转化程度。

镜下淋巴细胞形态可以见到以下几种类型。

（1）淋巴母细胞胞体比未转化淋巴细胞大3～4倍，呈圆形或椭圆形，胞浆染色淡蓝，可有伪足、空泡，细胞核增大，核质疏松，呈细网状，可见分裂现象。

（2）过渡型淋巴细胞形态介于淋巴母细胞和正常淋巴细胞之间，体积稍大，多为12～15µm，胞浆稍多，淡蓝色，核稍大，核质疏松。

注意与大淋巴细胞区别，后者虽然体积较大，但核质致密，胞浆较少，嗜碱性强。

（3）正常淋巴细胞与未经刺激的淋巴细胞一样，体积小，核质致密，胞浆少，嗜碱性强。

3．细胞毒T细胞（CTL）在体外能特异性杀伤带有相同抗原的某些敏感传代瘤细胞株（靶细胞）。

将适当的靶细胞悬液按一定比例与受检淋巴细胞混合，培养数小时后观察靶细胞的破坏情况可判断受检者的CTL杀伤能力，进而判断其细胞免疫状态。

常用方法

有形态学检查法和51Cr释放法。

CTL杀伤功能测定是体外检测机体细胞免疫功能的一种常用方法。

利用靶抗原与淋巴细胞的相互关系阐明靶细胞的抗原性；用于判断肿瘤患者的预后及免疫治疗效果；观察药物、肿瘤抗原以及其他抗原对CTL杀伤功能的影响；鉴定淋巴细胞的功能性亚群等。

4．吞噬细胞功能测定从趋化、吞噬和杀菌三个方面进行检测。

常用的方法：

趋化功能测定的有滤膜渗透法、琼脂平板法，吞噬功能测定的有吞噬试验，杀菌功能测定的有

NBT还原试验、杀菌功能试验、化学发光试验等方法。

五.论述题

2．Ficoll—hypaque分离液分离PBMC的原理：

血液单个核细胞包括淋巴细胞和单核

细胞。

人外周血单个核细胞的密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度在1.090～

1.093。

利用密度为1.077±0.001的Ficoll—hypaque分层液，将待分离的细胞悬液小心铺

于其上，经离心后单个核细胞悬浮于分层液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底，据此可将血液中的单个核细胞与其他细胞分离开。

Ficoll—hypaque：

分离液分离PBMC的步骤：

（1）取静脉血，加肝素溶液抗凝，再加入等量Hanks液，混匀。

（2）取分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界

面。

稀释血液与分层液的容积比例以2:

1—3:

l为宜。

（3）置水平离心机中离心2000r／min20min。

（4）离心后从离心管底部到液面分为五层，依次为红细胞沉淀层、粒细胞层、分层

液层、白雾状单个核细胞层、血浆层（含血小板和破碎细胞）。

（5）用滴管直接吸出单个核细胞层，置于另一离心管中。

（6）加入5倍量以上的Hanks液，充分混匀，离心1000r／min10min。

离心后倾弃上清液，再用Hanks液洗涤2次。

（7）用含10％～20％，灭活小牛血清的Hanks液或培养液配制细胞悬液。

计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝染色检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。

注意事项：

（1）将血液适当稀释，减低血液黏稠度有利于提高单个核细胞的收获率。

（2）温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。

故应在室温（18～25℃）下进行实验，分层液使用前应预温至室温。

（3）分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。

（4）将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。

（5）分离时的转速与时间应根据不同标本作相应调整。

离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间；若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或缩短离心时间。