免疫细胞的分离及表面标志检测技术免疫细胞功能.docx

1、免疫细胞的分离及表面标志检测技术免疫细胞功能第十四章免疫细胞的分离及表面标志检测技术第十五章免疫细胞功能检测技术Separation and Assays for Immunocyte第一部分 目的要求和教学内容一、目的要求掌握：Ficollhypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测，NK细胞的活性、中性粒细胞、巨噬细胞功能的检测方法；熟悉：T细胞功能的体内试验、T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。二、教学内容 1免疫细胞的分离与纯化：细胞的分

2、离，外周血单个核细胞的分离，淋巴细胞的纯化与亚群分离，吞噬细胞的分离。2淋巴细胞的数量检测：T细胞数量检测，B细胞数量检测。 3淋巴细胞的功能检测：T细胞功能检测，B细胞功能检测，NK细胞活性测定。 4吞噬细胞功能检测：中性粒细胞功能检测，巨噬细胞功能检测。第二部分 测 试 题一、选择题(一)单项选择题(A型题)1外周血中的单个核细胞主要是指A淋巴细胞 B嗜酸粒细胞 C单核细胞一淋巴细胞D单核细胞 E中性粒细胞2分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为A 1.030 B 1.035 C 1.092D 1.020 E 1.0773用FicolIhypaque分层液分离PBMC,分离的PBMC层位于

3、试管的A血浆层之上 B血浆层之中 C血浆层与分层液之间D分层液之中 E试管底部4用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主 要是 A粒细胞 B淋巴细胞 C单核细胞DT细胞 EB细胞5能与SRBC占合形成E花环的细胞主要是AT细胞 BB细胞 C单核细胞D粒细胞 E血小板6用小鼠抗人CD3单克隆抗体检测T细胞，其结果代表的是AT 细胞总数 BTh 胞数 CTs细胞数DCD4细胞数 ECD8胞数7用尼龙棉柱分离细胞时，不易黏附尼龙棉纤维而被洗脱的细胞是A粒细胞 BB 细胞 C单核细胞DT 细胞 E血小板8表示淋巴细胞的活力常用A活淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比B活

4、细胞浓度C淋巴细胞浓度 D活细胞和总细胞的比值ET细胞和B细胞的比例9用腹腔渗出法可从动物的腹腔渗出液中分离出A血小板 BB细胞 C单核细胞DT细胞 E巨噬细胞10活细胞经台盼蓝染色后呈A蓝色 B棕色 C红色D不着色 E天青色11荧光标记法计数外周血B淋巴细胞，检测的特有的表面标志是ACDl9 BCD20 C补体受体DSmIg EFcR12NK细胞特有的表面抗原是ACD2 BCDl6 C无特异的表面抗原DCD23 ECD5613仅能使T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是APHA BPWM CLPSDConA EEBV14能使B细胞和T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是APHA BPWM CLPSDSP

5、A EEBV15检查体液免疫功能最常用的方法是A血清免疫球蛋白定量测定 B溶血空斑试验CB淋巴细胞计数 D淋巴母细胞转化试验 ESmlgG测定16溶血空斑试验用于检测下列何种细胞的功能AT细胞 BB细胞 C中性粒细胞D吞噬细胞 ENK细胞17测定T淋巴细胞功能的体内试验是A锡克试验 B狄克试验 C结核菌素试验D天然血型抗体滴度 E血清：IgG测定18正常人外周血T淋巴细胞转化率为A 9019常用检测细胞毒效应的方法是A3H-TdR掺人法 B125I释放法 C51Cr释放法D形态学检测法 ECD8检测法20包被有抗Ig抗体的亲和板，其吸附的是AT细胞 BB细胞 CNK细胞DNKT细胞 E吞噬细胞

6、21Ficollhypaque液分离淋巴细胞是一种A不连续密度梯度离心法 B连续密度梯度离心法C亲和层析法 D离子交换层析法 E自然沉降法22Ficollhypaque淋巴细胞分离液的主要成分是A聚蔗糖 B泛影葡胺 C聚乙二醇D聚蔗糖+泛影葡胺 E聚蔗糖+聚乙二醇23Percoll分离液的主要成分是A聚蔗糖 B泛影葡胺C聚乙二醇 D聚乙烯吡咯烷酮 E经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒24检测中性粒细胞杀菌功能的方法是ANBT还原试验 B白细胞计数 C溶血空斑试验 D淋巴母细胞转化试验 E补体介导的细胞毒试验25MTT比色法检测IL-2活性，下列哪项是错误的A需要IL一2依赖细胞株 B增殖细胞具有吸

7、收MTT的能力C颜色的深浅代表细胞代谢活性的强弱 D可反映B细胞的功能 E可反映T细胞的功能 (二)多项选择题(x型题)1淋巴细胞分离液要求符合的条件有 A对细胞无毒 B高渗 C不溶于血液 D无色 E有合适的比重2与T细胞计数有关的表面抗原是 ACD2 BCD3 CCD4 DCD8 ECDl93与B细胞计数有关的表面标志是 ASmIg BCDl9 CCD20 DCD21 ECD24符合淋巴母细胞转化的形态学特征有 A细胞体积变小 B核仁明显、核染质疏松 C可见有丝分裂 D胞浆极少，呈天青色 E胞内可见空泡5用酶联免疫斑点试验检测B细胞功能的优点有 A稳定、特异 B可检测抗体分泌细胞 C可检测抗

8、体的分泌量 D可同时进行B细胞计数 E可同时检测不同抗原诱导的不同抗体的分泌6细胞免疫功能测定包括以下哪些 AT细胞计数 BB细胞计数 CT细胞功能测定 DTc细胞效应测定 E细胞因子测定 7检测淋巴细胞亚群常用的方法有 A免疫荧光法 B流式细胞仪测定 C酶免疫组化法 D放射免疫法 E免疫金染色法8细胞免疫功能体内试验方法有 A细胞毒试验 B混合淋巴细胞反应 C皮肤试验 D淋巴细胞增殖试验 E接触性过敏试验9T细胞增殖试验常用的检测方法有 A流式细胞仪法 B形态学方法 C51Cr释放法 DMTT检测法 E3H一FdR掺人法10检测吞噬细胞功能的方法有A吞噬试验 B杀菌试验 CNBT还原试验D化

9、学发光测定法 E趋化功能测定法11淋巴细胞亚群的分离方法有AE花环分离法 B尼龙棉柱分离法 c亲和板结合分离法D免疫磁珠分离法 E超速离心分离法12T细胞数量检测包括A.T细胞增殖试验 B间接荧光免疫法 C酶免疫组织化学法D微量细胞毒试验 E花环技术13检测T细胞数量的花环试验有A酵母菌花环试验 B补体C3b花环试验 CE花环试验D葡萄球菌花环法 E抗体致敏细胞花环法14B细胞表面具有、AmIg BCD抗原 CFc受体D补体受体 EEB病毒受体15B细胞数量检测的方法包括AmIg的检测法 BCD抗原检测法 CFc受体检测法D补体受体检测法 E小鼠红细胞受体检测法16B淋巴细胞功能的测定方法有A

10、B细胞增殖试验 B溶血空斑试验 C酶联免疫斑点法D体内测定法 E形态学检查法17中性粒细胞吞噬和杀菌功能的测定方法A形态学检查法 B显微镜检查法 C溶菌法DNBT还原试验 E化学发光测定法18巨噬细胞功能的检测方法包括A炭粒廓清试验 B吞噬功能检测 C巨噬细胞溶酶体酶测定D细胞毒作用测定 E巨噬细胞促凝血活性测定(三)配伍题问题1-3A红细胞层B粒细胞层C单个核细胞层D血浆与血小板层E淋巴细胞分离液层1.采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，最上层是2.采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，最下层是3.采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，第二层是问题4-6A淋巴细胞转化试验B溶血空斑试

11、验C炭粒廓清试验D琼脂糖凝胶平板法E化学发光测定法4巨噬细胞吞噬功能的检测：5中性粒细胞趋化功能的检测：6中性粒细胞吞噬和杀菌功能的检测：二、填空题1PBMC包括（ ）和（ ）。2在反相溶血空斑试验中，每一个空斑代表一个（ ）。3B细胞表面特异的标志是（ ）。4常用的测定淋巴细胞活力的方法是（ ）。5淋巴细胞转化情况的判定方法有（ ）、（ ）和（ ）。6淋巴细胞转化试验应用的同位素是（ ），细胞毒试验应用的同位素是（ ）7分离外周血白细胞常用的方法是（ ）和（ ）。8去除白细胞悬液中残留红细胞的常用方法有（ ）和（ ）。9去除单个核细胞悬液中单核细胞的常用方法有（ ）和（ ）。10检测T细胞数

12、量的花环技术包括（ ）（ ）和（ ）；检测B细胞数量的花环技术主要有（ ）和（ ）。11.淋巴细胞和单核细胞的密度为 （ ）。12外周血经Ficoll分离液离心后从上到下分为（ ）（ ）及（ ）层。三名词解释1外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)2E花环试验(erythrocyte rosette test)3淋巴母细胞转化试验(1ymphoblast transformation assay)4溶血空斑试验hemolytic plaque assay)5四唑氮蓝还原试验(nitroblue tetrazolium recovery

13、assay，NBT还原试验)四、简答题1简述T淋巴细胞转化的试验原理和镜下淋巴细胞转化形态学特征。2叙述T细胞介导的细胞毒试验的原理、意义和方法分类3测定吞噬细胞功能有哪些常用方法?五论述题简述Fic011一hypaque分离液分离PBMC的原理、步骤和注意事项。第三部分 参考答案与题解一、选择题(一)单项选择题(A型题)1C 2E 3C 4B 5A 6A 7D 8A 9E 10D11D 12C 13A 14B 15A 16B 17C 18C 19C 20B21A 22D 23E 24A 25D(二)多项选择题(X型题)1ACDE 2ABCD 3ABCD 4BCE 5ABCDE 6ACDE7A

14、BCE 8CE 9BDE 10ABCDE 11ABCD 12BCDE13CDE 14ABCDE 15ABCDE 16ABCD 17BCDE 18ABCDE(三)配伍题1.D 2.A 3.C 4.C 5.D 6.E二、填空题1淋巴细胞单核细胞2分泌Ig的细胞3SmIg4台盼蓝染色法5形态学方法。HTdR掺入法MTI检测法63 H，51Cr7自然沉降法聚合物加速沉降法8无菌蒸馏水低渗裂解法083氯化铵处理法9黏附去除法，羰基铁粉吞噬去除法10E花环试验葡萄球菌花环法抗体致敏红细胞花环法 EA花环试验EAC花环试验11.淋巴细胞和单核细胞的密度为 1.077+0.001。12外周血经Ficoll分离

15、液离心后从上到下分为_血清_，_PBMC及_粒细胞、红细胞_层。三、名词解释1PBMC：外周血单个核细胞主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。2E花环试验：T细胞表面有特异性绵羊红细胞(SRBC)受体，即E受体。将T细胞与SRBc按一定比例混匀，置4h至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与SRBC结合形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的花环样结构，镜检计数可得总花环(Et)形成率，亦即T细胞的百分率。3淋巴母细胞转化试验：细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞出现一系列的增殖反应，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，并发生形态

16、返祖变化，如细胞变大、胞质增多、胞质出现空泡、核染色质疏松、核仁明显，这种淋巴细胞增殖反应又称淋巴细胞母细胞转化(1ymphoblast transformation)。4溶血空斑试验：该方法用于检测实验动物抗体形成细胞数目。其基本原理是抗体形成细胞分泌的Ig与SRBc上的抗原结合，在补体作用下出现溶血反应。方法是将SRBC与其免疫的小鼠脾细胞、补体及适量琼脂糖液混合倾注平板，或者将吸附有已知抗原的SRBc与待检B细胞、补体及适量琼脂糖液混合倾注平板，温育一定时间，抗体形成细胞释放的抗体会使周围SRBc致敏，并在补体作用下出现肉眼可见的溶血空斑，每一空斑中央含有一个抗体形成细胞，因此空斑数量即

17、代表抗体形成细胞数。5NBT还原试验：活化的中性粒细胞与NBT一起温育，由于中性粒细胞吞噬杀菌过程中产生超氧阴离子(O2-)，使被吞进细胞内的NBT由原来呈淡黄色还原成不溶性的蓝黑色颗粒，沉积在细胞浆中，称为NBT阳性细胞。光学显微镜下计数NBT阳性细胞，其百分率可反映中性粒细胞的杀菌功能。四、简答题1T淋巴细胞转化试验原理：T淋巴细胞在受到非特异性有丝分裂原或特异性抗原刺激后能发生增殖反应，细胞代谢旺盛，蛋白质和核酸合成增加；与此同时细胞体积增大，分裂呈母细胞样，此为淋巴细胞转化现象。因此可借助形态学方法观测淋巴细胞形态变化情况，3H一胸腺嘧啶核苷(3HFdR)掺入法测定DNA合成情况，或M

18、TT比色法测定线粒体代谢活性即可判定淋巴细胞转化程度。 镜下淋巴细胞形态可以见到以下几种类型。 (1)淋巴母细胞胞体比未转化淋巴细胞大34倍，呈圆形或椭圆形，胞浆染色淡蓝，可有伪足、空泡，细胞核增大，核质疏松，呈细网状，可见分裂现象。 (2)过渡型淋巴细胞形态介于淋巴母细胞和正常淋巴细胞之间，体积稍大，多为1215m，胞浆稍多，淡蓝色，核稍大，核质疏松。注意与大淋巴细胞区别，后者虽然体积较大，但核质致密，胞浆较少，嗜碱性强。 (3)正常淋巴细胞与未经刺激的淋巴细胞一样，体积小，核质致密，胞浆少，嗜碱性强。 3细胞毒T细胞(CTL)在体外能特异性杀伤带有相同抗原的某些敏感传代瘤细胞株(靶细胞)。

19、将适当的靶细胞悬液按一定比例与受检淋巴细胞混合，培养数小时后观察靶细胞的破坏情况可判断受检者的CTL杀伤能力，进而判断其细胞免疫状态。常用方法有形态学检查法和51Cr释放法。 CTL杀伤功能测定是体外检测机体细胞免疫功能的一种常用方法。利用靶抗原与淋巴细胞的相互关系阐明靶细胞的抗原性；用于判断肿瘤患者的预后及免疫治疗效果；观察药物、肿瘤抗原以及其他抗原对CTL杀伤功能的影响；鉴定淋巴细胞的功能性亚群等。4吞噬细胞功能测定从趋化、吞噬和杀菌三个方面进行检测。常用的方法：趋化功能测定的有滤膜渗透法、琼脂平板法，吞噬功能测定的有吞噬试验，杀菌功能测定的有NBT还原试验、杀菌功能试验、化学发光试验等方

20、法。五.论述题2Ficollhypaque分离液分离PBMC的原理：血液单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。人外周血单个核细胞的密度为1.0501.077，而粒细胞和红细胞的密度在1.0901.093。利用密度为1.0770.001的Ficollhypaque分层液，将待分离的细胞悬液小心铺于其上，经离心后单个核细胞悬浮于分层液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底，据此可将血液中的单个核细胞与其他细胞分离开。 Ficollhypaque：分离液分离PBMC的步骤：(1)取静脉血，加肝素溶液抗凝，再加入等量Hanks液，混匀。(2)取分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界

21、面。稀释血液与分层液的容积比例以2:13:l为宜。(3)置水平离心机中离心2000rmin 20min。(4)离心后从离心管底部到液面分为五层，依次为红细胞沉淀层、粒细胞层、分层液层、白雾状单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。(5)用滴管直接吸出单个核细胞层，置于另一离心管中。(6)加入5倍量以上的Hanks液，充分混匀，离心1000rmin 10min。离心后倾弃上清液，再用Hanks液洗涤2次。(7)用含1020，灭活小牛血清的Hanks液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝染色检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。 注意事项：(1)将血液适当稀释，减低血液黏稠度有利于提高单个核细胞的收获率。(2)温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(1825)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。(3)分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。(4)将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。(5)分离时的转速与时间应根据不同标本作相应调整。离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间；若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或缩短离心时间。