Maillard反应制备酪蛋白单糖复合物的研究.docx
《Maillard反应制备酪蛋白单糖复合物的研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Maillard反应制备酪蛋白单糖复合物的研究.docx（39页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
Maillard反应制备酪蛋白单糖复合物的研究
毕业设计（论文）
题目：
Maillard反应制备酪蛋白-单糖复合物的研究
子题：
专业：
食品科学与工程指导教师：
姜淑娟
学生姓名：
王浩班级-学号：
营养081-12
2012年06月
大连工业大学本科毕业设计（论文）
Malliard反应制备酪蛋白-单糖复合物的研究
Preparationofcasein-monosaccharideconjugatethroughtheMaillardreaction
设计（论文）完成日期2012年06月12日
学院：
食品学院
专业：
食品科学与工程（公共营养方向）
学生姓名：
王浩
班级学号：
营养081-12
指导教师：
姜淑娟
评阅教师：
2012年06月
摘要
美拉德反应（Maillard反应）是一种蛋白质与还原糖在加热条件下即可发生的非酶促糖基化反应，可在一定程度上改善蛋白质的某些功能性质。
本论文以酪蛋白与葡萄糖及酪蛋白与果糖两种单糖反应体系，通过控制Maillard反应程度来研究不同Maillard反应产物性质与反应程度之间的关系，从而研究单糖Maillard反应对酪蛋白功能性的影响效果，从而以酪蛋白-单糖Maillard反应对酪蛋白改善效果显著的功能性质为指标，对Maillard反应条件进行响应面优化，从而确定酪蛋白-单糖Maillard反应改善该功能性质的最佳反应条件，在最佳反应条件下制备酪蛋白-单糖复合物，对其功能性质验证实验，评价该模型对Maillard反应的模拟效果。
单因素实验结果表明，酪蛋白-葡萄糖Maillard反应对酪蛋白乳化性的改善效果有明显规律性，且在pH11，温度90℃和反应时间20min时乳化性质最好，改善效果最明显。
响应面实验结果表明，酪蛋白-葡萄糖Maillard反应改善酪蛋白乳化性的最佳反应条件为：
反应时间20.0min，pH11.2，反应温度92.0℃，在此条件下制备的酪蛋白-葡萄糖复合物的乳化活性为223.14m2·g-1，乳化稳定性为88.94%。
酪蛋白-葡萄糖复合物的乳化活性和稳定性要比酪蛋白分别提高8.17%，18.46%。
关键词：
酪蛋白；葡萄糖；果糖；Maillard反应；乳化性
Abstract
Maillardreactionistheenzymaticreactionbetweenproteinsandreducingsugarsonheatingconditions,whichcanimprovesomefunctionalpropertiesofproteinstosomeextent.
Intheexperiment,caseinandtwotypicalreducingmonosaccharideglucose,fructosewereselectedasthesubstrateandMaillardreactioninaqueoussolutionwasappliedtomodifycasein.TheextentofMaillardreactionoccurredupondifferentconditionsandtheinfluenceonthefunctionalpropertiesofcaseinwasstudied,thenthefunctionalpropertiesofthecaseinimprovedmarkedlywasusedastheindex,theMaillardreactionconditionswereoptimizedusingtheresponsesurfacemethod.Sothedesignedfunctionalcasein-monosaccharideconjugatewasobtainedandevaluated.
Singlefactorexperimentresultsshowedthatthecasein-glucoseMaillardreactionimprovedcaseininemulsibility,andthebetterconditionforsolubilitywaspH11,90℃and20min.Theresponsesurfaceexperimentalresultsshowedthatthereactiontime,reactiontemperature,pHofreactionsystemallinfluencesignificantlytheemulsibility,theoptiumMaillardreactionconditionsis:
pH11.2,reactiontemperature92.0℃andreactiontime20.0min.Onthiscondition,casein-glucoseconjugatewaspreparededandresultsindicatedtheemulsionabilitywas223.14m2·g-1andtheemulsionstabilitywas88.94%.Theemulsionabilityandemulsionstabilityofthecasein-glucoseconjugatewasincreasedby8.17%and18.46%respectively,comparedtotherawcasein.
KeyWords：
casein;glucose;fructose;Maillardreaction;emulsibility
目录
摘要I
AbstractII
第一章绪论1
1.1蛋白质概述1
1.1.1蛋白质种类1
1.1.2蛋白质功能性质2
1.1.3蛋白质改性技术2
1.2酪蛋白概述3
1.2.1酪蛋白3
1.2.2酪蛋白组成3
1.2.3酪蛋白功能性质4
1.2.4酪蛋白功能性的应用5
1.3Maillard反应概述6
1.3.1Maillard反应6
1.3.2反应方式6
1.4Maillard反应改善蛋白质功能性质研究7
1.4.1改善乳化性研究7
1.4.2改善起泡性研究8
1.4.3改善溶解性研究8
1.4.4改善抗氧化性能9
1.5本论文研究内容及目的9
第二章材料与方法11
2.1实验材料11
2.1.1材料与试剂11
2.1.2仪器与设备12
2.2实验方法12
2.2.1Maillard反应对酪蛋白改善功能性质影响12
2.2.2pH条件对复合物乳化性质的影响13
2.2.3乳化性的Maillard反应条件优化13
2.3测定方法14
2.3.1pH测定14
2.3.2蛋白质含量测定14
2.3.3溶解性测定14
2.3.4粘度测定15
2.3.5乳化性测定15
第三章结果与讨论16
3.1不同Maillard反应产物的制备16
3.2反应时间对复合物功能性的影响18
3.2.1对溶解能力的影响18
3.2.2对粘度的影响19
3.2.3对乳化性的影响19
3.3pH条件对复合物乳化性的影响21
3.4以乳化性为指标Maillard反应条件优化22
3.4.1响应面结果分析22
3.4.2回归方程的建立与分析22
3.4.3Maillard反应最优水平的确定24
3.5响应面验证试验27
结论28
参考文献29
致谢32
第一章绪论
1.1蛋白质概述
1.1.1蛋白质种类
蛋白质主要由碳、氢、氧和氮原子组成，是所有生命细胞极其重要的结构成分和活性物质，是重要的营养素之一。
有些还含有硫原子，构成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸之间以肽键连接。
蛋白质分类方法很多，主要有一下几种：
按照蛋白质分子外形的不同，可将其分为球状蛋白质，纤维状蛋白质以及膜蛋白质三大类：
球状蛋白质分子具有接近球形的形状，同时具有较好的水溶性，很多的种类，其可行使的生物学功能也多种多样；纤维状蛋白质分子的外形呈纤维状或棒状，大多数都不溶于水，是生物体结构的重要的组成成分，可能起到保护生物体的作用；膜蛋白质分子大多折叠成近似球形，插入到生物膜中间，另外一些在生物膜的表面通过共价键或非共价键与之结合。
膜蛋白能够实现生物膜的多数功能。
按照蛋白质的主要来源不同，可将其分为动物性蛋白和植物性蛋白两类。
这两类蛋白质中所含的氨基酸不同，因而它们所具有的营养价值也有所差异。
植物性蛋白质主要是来源于米面类、豆类的蛋白质，但是米面类和豆类的蛋白质营养价值不同。
米面类来源的蛋白质中缺少赖氨酸（一种必需氨基酸），因此其氨基酸评分较低，仅为0.3～0.5，这类蛋白质被人体吸收和利用的程度也会差些。
大豆蛋白质是最好的植物性优质蛋白质，有“植物肉”之美称，是良好的植物性蛋白质的补充源。
动物性蛋白主要来源于鱼虾、禽肉、畜肉、蛋类及牛奶。
一般说来动物性蛋白质大多属于优质蛋白质，这是因为动物蛋白质含有量多且是人体所必需的氨基酸，在人体内吸收率高其营养价值也高。
动物蛋白的构成以酪蛋白为主（78～85%），能较好的被成人吸收、利用。
更重要的是，动物蛋白含有人体所需的全部8种必需氨基酸，且比例合理，与人体比例接近，因此与一般的植物性蛋白相比，动物性蛋白更易被人体消化、吸收和利用。
1.1.2蛋白质功能性质
蛋白质不仅是重要的营养物质，而且还具有许多重要的功能性质，蛋白质的功能性指的是蛋白质在食品加工的过程中能够使食品产生特征的物理、化学性质，这些都是对蛋白质应用在食品加工过程中具有非常重要的价值的功能性质。
蛋白质的功能性质可分为三类：
一是蛋白质－水的相互作用（即蛋白质的水合性），包括：
吸水能力、持水能力、溶胀性、湿润性、分散性、粘着性、粘度和溶解度；二是蛋白质－蛋白质的相互作用，只有在蛋白质发生凝胶作用、沉淀作用或形成其它各种结构（例如面筋）时这种相互作用才具有实际意义；三是表面性质，主要是指起泡性能和乳化性能等表面张力[1,2]。
蛋白质的功能性质有非常复杂的影响因素，蛋白质的含量及结构，各蛋白组分的聚集以及解聚状态，蛋白质变性的程度以及蛋白产品中非蛋白质部分的组成等因素都是很重要的影响因素。
除上述这些内在的影响因素外，许多的外部因素（如，pH、温度和离子强度等）也对蛋白类产品的功能性质起着一定的影响作用。
蛋白类产品生产工艺的不同也对蛋白类产品中蛋白质的分子结构与组成有一定的影响，进而对产品的功能性质产生影响。
1.1.3蛋白质改性技术
蛋白质被广泛应用于增加食物凝胶性和乳化性等功能特性。
这些属性取决于蛋白质的分子结构，pH值及其所处的理化环境等因素。
食品中的蛋白质对热和有机溶剂不稳定，易受到蛋白酶的水解，故在工业上的应用受到一定的限制，因而需要对蛋白质的以上缺陷加以改进[3]。
蛋白质的改性技术有物理、化学（酰化、糖基化、磷酸化及去酰胺等）和酶（生物工程）等方法。
在这些方法中，物理方法的效果不够显著；化学方法则具有一定毒性。
所以近期国内外把研究重点转移到通过蛋白质-糖Maillard反应改变蛋白质功能性质的研究上。
1.2酪蛋白概述
1.2.1酪蛋白
酪蛋白，又称酪朊、酪素、干酪素、乳酪素等。
是等电点为pH=4.6的两性蛋白质。
是由α、β、γ三种酪蛋白按一定比例组成的含磷复合蛋白。
在牛奶中以磷酸二钙、磷酸三钙或二者的复合物而存在，也是干酪的主要成分。
酪蛋白的构造非常复杂。
纯酪蛋白为白色至浅黄色颗粒状或粉状，无嗅无味。
相对分子质量约为57000～375000，相对密度1.25～1.31。
不溶于水，溶于碱性溶液及浓酸，但在稀酸中沉淀。
有吸湿性，干燥时稳定，吸湿后迅速变质。
以磷蛋白质的形成成为重要的营养蛋白，含氮量约为15.2%。
作为牛乳蛋白的主要成分之一，酪蛋白中的必需氨基酸组成较为合理，且含有丰富的赖氨酸，是一种良好的动物蛋白质。
酪蛋白的生物价为70，其中含有全部的蛋白质和氨基酸，以及含量丰富的8种必需氨基酸，故称酪蛋白是营养价值最高的蛋白质之一。
酪蛋白中含少量的中性酪蛋白钙，可将酪蛋白用金属盐饱和从而从溶液中沉淀析出，在有甲醛存在的情况下，能形成一个蛋白塑粉物，该物质不溶于水，且性状较硬。
1.2.2酪蛋白组成
酪蛋白组分主要有α（75%）、β（22%）、γ（3%）和к四种[4]，酪蛋白各类单体间易发生聚合，且其分子量均为2～3万，且都含部分磷元素（磷含量约为0.59％）。
α-酪蛋白大约占牛乳中总酪蛋白含量的1/2，主要有αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白两种形式，αs1-酪蛋白由199个结合有8个磷酸根离子的氨基酸组成，其结合位点大多集中于肽链第43-79位值处，在此结合部位经过酶解所得到的含磷肽，可与钙、铜、铁、锌等金属离子结合而形成可溶性的盐，具有促进体内金属离子吸收的能力。
β-酪蛋白由结合5个磷酸根离子的209个氨基酸组成，其结合位点大多集中于肽链的第14-21位值处，形成了一个高度磷酸化的区域。
在溶液中β-酪蛋白在小于8℃或pH较高的情况下以单体形式存在，而当温度过高或pH接近中性的条件下，则会形成多聚体。
α-酪蛋白及β-酪蛋白易受到钙离子的影响凝聚而形成沉淀。
γ-酪蛋白只占酪蛋白的很少一部分，γ-酪蛋白是乳汁分泌的内源性蛋白酶在对β-酪蛋白中的某些部分进行降解时产生的。
所以γ-酪蛋白与β-酪蛋白在一些性能上具有相似性。
κ-酪蛋白是糖蛋白的一种，岩藻糖、唾液酸、半乳糖苷等碳水化合物结合在距肽链C端的三分之一处形成了κ-酪蛋白。
另外在κ-酪蛋白肽链的11位和88位上存在两个半胱氨酸的残基，在κ-酪蛋白中也发现了结合在二硫键上的双歧杆菌生长因子。
κ-酪蛋白有A、B两个遗传变异体，κ-酪蛋白B中含有169个氨基酸残基，其分子中仅含有一个磷酸酯键的存在，且对钙离子不敏感，所以当有钙离子存在时，κ-酪蛋白B能够与对钙离子敏感的α-酪蛋白及β-酪蛋白形成热力学上相对稳定的某些微粒。
1.2.3酪蛋白功能性质
酪蛋白的功能性质主要体现在溶解性，乳化性和凝胶作用等。
溶解度是蛋白质-溶剂和蛋白质-蛋白质间相互作用进而达到平衡的热力学上的表现形式。
溶解性越好的蛋白质必然也具有较好的功能性[5]，会具有良好的乳化性、发泡性、凝胶性以及良好的脂肪氧化酶活性，易于食品的加工和利用，也相对容易被加入到食品中。
酪蛋白中氨基酸残基的疏水性与其溶解度有关，疏水性越小的酪蛋白的溶解度就越大。
同时，蛋白质浓度、pH、温度、以及离子强度也能影响酪蛋白溶解度的大小。
乳化性是指油和水相互混合后所形成乳状液的性能。
酪蛋白作为能同时与水和油脂相互作用的两性物质，其所含的疏水区和亲水区较为明显，疏水区和亲水区可自发迁移至油-水界面及气-水界面，到达界面上后，亲水基团定向至水相而疏水基团定向至油相和气相并能够广泛展开、散布，在其界面能形成蛋白质的吸附层，以达到稳定乳状液的作用。
因而，酪蛋白具有较好的乳化性和发泡性。
酪蛋白及其制品的乳化液发泡性在低pH值或等电点的附近时，没有稳定的泡膜形成。
酪蛋白制品在去磷酸根后表面所带静电荷减少，使其静电引力降低，从而使稳定性下降，导致泡膜较短时间内消失。
天然的酪蛋白发泡性相对较好，当pH值为7-8时，酪蛋白所形成的泡膜是最稳定的。
凝胶作用指的是一定条件下，变性蛋白质分子聚集而形成的有规则的蛋白质的网状结构，将水和其它物质留在其中的过程。
凝胶作用主要受蛋白质-蛋白质相互作用的大小的影响，蛋白质的凝胶强度和稳定性随蛋白质之间相互吸引力的增大而增大，蛋白质-蛋白质间的相互吸引力主要是依靠蛋白质分子之间的静电相互作用（盐键）、疏水相互作用、氢键以及二硫键而产生的。
目前酪蛋白多用来作为食品原料或制备微生物的培养基使用，利用蛋白质的酶促水解技术可以制得具有防止矿物质流失，防治骨质疏松与佝偻病，预防龋齿，促进动物体外受精，治疗缺铁性贫血，调节血压，治疗缺镁性神经炎等多种生理功效的酪蛋白磷酸肽，其具有能促进常量元素与微量元素的高效吸收，这种功能性使其享有“矿物质载体”的美称。
1.2.4酪蛋白功能性的应用
酪蛋白和酪蛋白制品有着良好的功能特性和较高的营养价值，因此在食品工业和其他工业中都得到了广泛的应用[6]。
肉制品：
70年代，90%的酪蛋白和酪蛋白制品用于肉工业。
在肉制品中添加酪蛋白和酪蛋白制品，利用其乳化特性和保水性，同时强化了蛋白质，一般添加量为5%。
由酪蛋白和酪蛋白制品制得的人造肉，有肉的风味，但耐热性较差。
烘焙食品：
在烘焙食品及谷物制品中添加酪蛋白和酪蛋白制品，强化了蛋白质。
还利用其保水性来控制烘焙食品的形状和水分含量，赋于烘焙食品良好的色泽、风味和稳定性，使用量一般为5%～20%。
人造奶油和咖啡伴侣：
在人造奶油中添加酪蛋白和酪蛋白制品，可以提高粘度，形成一定的凝胶，使人造奶油更稳定。
酪蛋白和酪蛋白制品还可以用来生产咖啡伴侣，用量为7%～10%。
干酪类似物：
将酪蛋白、酪蛋白制品、植物油、有机酸和风味物质等混合在一起，生产出干酪类似物，其产量已占美国干酪产量的5%。
饮料:
酪蛋白和酪蛋白制品可以用来生产再制奶，其乳糖含量低，适合乳糖不耐症的人饮用。
酪蛋白制品在低pH值时，有较好的溶解性，可用作生产酸性乳饮料。
另外，酪蛋白和酪蛋白制品已广泛应用在婴儿食品、发酵乳制品、油脂、纺织、皮革、染料等工业部门。
1.3Maillard反应概述
1.3.1Maillard反应
Maillard反应又称羰氨反应[8]，指含有氨基的化合物和含有羰基的化合物之间经缩合、聚合而生成类黑精的反应。
此反应最初是由法国化学家美拉德于1912年在将甘氨酸与葡萄糖混合共热时发现的，故称为Maillard反应[7]。
由于产物是棕色的，也被称为褐变反应。
反应物中羰基化合物包括醛、酮、还原糖。
氨基化合物包括氨基酸、蛋白质、胺、肽。
反应的结果使食品颜色加深并赋予食品一定的风味，如：
面包外皮的金黄色、红烧肉的褐色以及它们浓郁的香味。
但是在反应过程也会使食品中的蛋白质和氨基酸大量损失，如果控制不当也可能产生有毒有害物质。
对于Maillard反应机理[9]，长期以来研究得还很不彻底。
食品化学家Hodge在早年作出了初步的解释，认为Maillard反应可以分成3个反应阶段。
目前对于Maillard反应初级、中级阶段机理已经基本明确，但是终级阶段机理还不是很明确。
1.3.2反应方式
常用的Maillard反应有两种方式[10]：
湿法反应，反应主要集中在单糖或双糖与结构简单的蛋白质之间，蛋白质与小分子的糖之间的Maillard反应使蛋白质的分子中交联了糖基。
又由于反应在液相体系中进行，蛋白质与还原糖的接触较均匀，反应较充分。
干热法反应：
通过干热法使其自发的进行Maillard反应，使蛋白质氨基基团与糖的还原性羰基末端反应，从而得到共价复合物。
所得复合物具有较好的热稳定性及乳化活性等功能性质。
干热Maillard反应属于固-固非均相反应，整个反应在非扰动的状态下进行，其中的蛋白质与还原糖的糖晶体间有序紧密的排列，从而导致扩散速度极慢，反应物间接触不均匀，反应不充分等问题，最终产物一般呈浅黄色或浅棕色。
1.4Maillard反应改善蛋白质功能性质研究
蛋白质与糖类物质通过Maillard反应的羰氨缩合作用，可对蛋白质的乳化性能、溶解性能和抗氧化性能产生一定的影响。
1.4.1改善乳化性研究
Beatriz（2007）等[11]通过研究发现，利用蛋白质-多糖的Maillard型糖基化反应可使原本在酸性或盐溶液中丧失乳化性能的β-乳球蛋白（β-LG）具有乳化性能，且随Maillard反应产物的降解而减弱。
Yu-Ting（2000）[12]等发现特别在中性或碱性（pH7～10）条件下，ε-聚赖氨酸-葡聚糖的乳化性能比现有市售的乳化剂好，其乳化性能不会因高盐浓度而下降，但会随pH的降低而减弱。
日本学者Takano（2007）[13]等选用紫菜聚糖对大豆分离蛋白进行不同条件下的Maillard反应，其中pH4.5下反应的生成物可在pH2.0～8.0广谱范围内具有较好的水溶性及乳化性能。
另外，在pH6.3下的反应生成物，除有上一产物较好的水溶性和乳化性能外，还表现出比大豆分离蛋白更耐受胰蛋白酶抑制剂的能力。
据相关学者研究发现，共价物的乳化性能还与糖类的分子大小[14]和糖的浓度有关系，在一定条件下，分子量越大，共价物的乳化性能就越好：
卵清蛋白与葡萄糖或二糖（乳糖、葡萄糖等）在控制一定的条件下所产生的共价物，因为蛋白质的聚集，乳化性能就相对较差，研究表明卵清蛋白、葡聚糖的质量比为1：
5时，乳化性能最好。
对于单糖的酪蛋白-葡萄糖共价物来说也有类似的情况。
1.4.2改善起泡性研究
泡沫体系的稳定性与界面张力有关，同时也与吸附层在界面上的流变特性有一定关系，所以研究糖蛋白共价复合物的界面流变性能为我们更好的了解它具有优越乳化或起泡性能的机制提供有力依据。
椭圆偏光和自动滴形张力结果显示：
β-乳球蛋白-低聚果糖共价复合物在空气-水界面上达到吸附平衡时的界面压力要远远比未改性的β-乳球蛋白低很多；表面弹性模量随着界面压力的增大而逐渐增大；并且糖基化蛋白明显地增加了界面膜厚度以及界面蛋白吸附量，这一结论将对食品相关体系产生较大的影响，比如我们可以将糖基化蛋白用来稳定由于外界压力等问题造成的啤酒泡沫的不稳定的现象。
1.4.3改善溶解性研究
Saeki[15~17]在研究低离子强度下，鱼肉蛋白质与还原糖发生糖基化反应使肌球蛋白水溶性增大的同，肌动蛋白对肌原纤维细丝的成形能力下降，并将以其单体形式存在于低离子强度的溶液中。
相关研究已发现，鲤鱼和贝类肌肉蛋白质在糖基化反应中分别有效利用了赖氨酸在69%和73%时，其肌动蛋白的等电点分别从4.98和5.03降到4.17和4.29，由此便可得到97%和83%的溶解性能。
此外，Saeki[18]在0.05mol/L低离子浓度溶液中利用鱼肉肌原纤维蛋白质与海藻酸盐的糖基化反应，仅消耗肌原纤维蛋白质中4%的赖氨酸便可将其蛋白质溶解性提高到76%。
同样Takeda[19]等将鱼肉鱼糜：
平均聚合度为6的藻胶低聚糖:
山梨醇按照1:
1:
1混合后，经冷冻干燥并在温度60℃、相对湿度5%~95%条件下，通过Maillard反应将低聚糖转接到肌原纤维蛋白上。
结果表明，反应随着相对湿度加大而增加，在相对湿度65%和95%时，结合到蛋白质的低聚糖量可达150μg/mg。
该糖基化反应尚可改变蛋白质的溶解性，特别是在相对湿度35%的反应产物有较好的水溶性和在室温下有较高的稳定性，这种糖基化反应也将作为加工过程中抑制蛋白质变性的有效手段。
Chung等（2005）[20]通过壳聚糖-多糖的Maillard反应来增加壳聚糖的水溶性，特别是在中性或碱性溶液中的溶解性能。
且pH一定时，壳聚糖-葡萄糖胺衍生物的溶解性比酸溶性的壳聚糖更好。
同时壳聚糖-葡萄糖胺尚具有较强的金属离子螯合性。
赵希荣[21]在利用壳聚糖作为氨基供应体与含醛基
升级会员 