三种荧光定量PCR检测方式比较.docx

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三种荧光定量PCR检测方式比较

三种荧光定量PCR检测方式比较

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以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR进程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。

定量PCR的可行性定量一样是在PCR扩增的指数期进行的。

常见检测方式可分为以下几类：

（1）SYBRGreenI检测模式

SYBRGreenI是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。

其与双链DNA结合后，荧光大大增强。

因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，能够依照荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

PCR扩增程序一样为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。

SYBRGreenI的缺点：

由于SYBRGreenI没有特异性，不能识别特定的双链，只若是双链就会结合发光，对PCR反映中的非特异性扩增或也会产生荧光，通常本底较高，因此在临床上利用可能会有假阳性发生。

SYBRGreenI的优势：

SYBRGreenI的优势是因为其缺点产生，由于它能所有的双链 相结合，因此对不同模板不需专门定制不同的特异性探针，通用性较好，而且价钱相对较低。

这对科研是很有利的，因此国内外在科研中利用比较普遍。

（2）水解探针模式（man探针）

TaqMan探针是一种探针，荧光基团连接在探针的5’结尾，而淬灭剂那么在3’结尾。

当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。

在进行延伸反映时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。

一分子的产物生成绩伴随着一分子的荧光信号的产生。

随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积存。

因此Taqman探针检测的是积存荧光。

PCR扩增程序一般是：

94℃～60℃40个循环。

经常使用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

（3） 探针模式（Beacon、FRET）

分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两头的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团牢牢靠近。

荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。

分子信标的茎环结构中，环一样为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补;茎一样5-7个核苷酸长，并彼此配对形成茎的结构。

荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂那么标记在另一端。

在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，若是有模板存在环序列将与模板配对。

与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。

当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。

由于是酶切作用的存在，分子信标也是积存荧光。

经常使用的荧光基团：

FAM，TexasRed。

PCR扩增程序一般是：

94～55～72℃三步法，40个循环。

FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5`端标记FAM荧光基团，另一探针的3`端标记Red640荧光基团。

当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发FAM产生的荧光，作为Red640基团的激发光被吸收，使Red640发出波长为640的荧光。

当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640波长的荧光。

由于FRET探针是靠近发光，因此检测信号是实时信号，非积存信号。

经常使用的荧光基团是：

LC-Red640，LC-Red705。

能用于实时荧光PCR定量的方式很多，各有优缺点，应依如实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方式。

下面为各类方式的比较：

实验中的一些好适应：

加入试剂之前，把它混匀一下，以避免放置时刻长了浓度不均;移液枪用完以后要归到最大计量的位置，避免久而久之弹簧失去弹性。

必然要记着关水浴箱，切记切记;多和大伙儿讨论，同时多关注他人讨论的体会，这几乎是最快提高的捷径了;所有的试剂都自己配，出了问题才好找缘故。

避免污染的方法：

1.所有的玻璃器皿均应在利用前于180℃的高温下干烤6h或更长时刻。

2.塑料器皿可用%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：

有机玻璃器具因可被氯仿侵蚀，故不能利用）。

3.有机玻璃的等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用%DEPC水冲洗，晾干。

4.配制的溶液应尽可能的用%DEPC，在37℃处置12h以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处置过的无菌双蒸水配制，然后经μm滤膜。

5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验进程中手套要勤换。

6.设置RNA操作专用，所有器械等应为专用。

经常使用的RNA酶：

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：

是一种强烈但不完全的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使，从而抑制酶的活性。

2.异硫氰酸胍：

目前被以为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

它既可破坏使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

3.氧钒核糖核苷复合物：

由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：

从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。

RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，能够和多种RNA酶结合，使其失活。

5.其它：

SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有必然抑制作用。

因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA进程中不能利用，而且它与一些缓冲液（例如Tri）不能相容

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离取得全长的RNA。

而实验失败的要紧缘故是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

RNA酶可耐受多种处置而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

研究人员造成的污染RNA酶最要紧的潜在污染源是研究人员的手。

因此进行RNA实验时应勤换手套。

但DEPC能与胺和巯基反映,因此含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处置

动植物总RNA提取-Trizol法：

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培育细菌，样品量从几十毫克至几克。

用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。

RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly（A）+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

1.将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品整体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2.研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手猛烈摇荡离心管15秒。

3.取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

4.弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

5.警惕弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过度，不然会降低RNA的溶解度。

然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保留于-70℃。

[注意]

1.整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

另外，提取上清这步必然要警惕，靠近沉淀的部份必然要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，阻碍比值

2.加氯仿前的匀浆液可在-70℃保留一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保留一周，-20℃保留一年。

总mRNA的提取体会：

一、关于TrizolReagent需要的试剂

1.Chloroform：

氯仿（分析纯）

2.Isoproplylalcohol：

异丙醇（分析纯）

3.75%Ethanol（inDEPC-treatedwater）：

75%乙醇。

要求用分析纯无水乙醇并用%的DEPC处置过的无Rnase的水稀释。

4.RNase-freewater：

无Rnase的水。

方式是：

将DEPC按%（V/V）加在dH2O中500ml（50ul），在37℃留宿，并高压灭菌即得（150℃3小时）

5.一次性塑料手套

6.注意：

DEPC有致癌之嫌

二、关于TrizolReagent的利用进程：

1.Homogenization（匀浆）

a.Tissues：

组织

每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。

b.CellsGrowninmonolayer（单层细胞接毒后显现病变的）

针对JEV细胞总RNA的抽提法：

BHK21细胞长成单层后，接毒（采纳大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）约5ml，维持天。

出现75%-100%的病变时，以PBS（预冷）冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几回，以裂解细胞（细胞瓶有两种经常使用规格：

大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂别离约为和3ml。

Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶底为度，而不是依据细胞的数量，不然可致使DNA的污染）具体方式如下：

（样品必然要新鲜）

（1）组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量必然要加足，不然易污染），混匀，吹吸几回，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物完全分离。

（2）加氯仿（每1mlTrizol试剂加入氯仿，盖好，猛烈震荡15s，置室温2-3分钟。

（3）4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。

RNA包括在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。

（4）认真吸取上层水相，移至另一EP管中。

（5）加异丙醇，以沉淀RNA（每1mlTrizol试剂加入异丙醇），置室温10min。

（6）4℃离心，10000g×10min。

RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。

（7）弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1mlTrizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4℃

离心，5500g×5min。

弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无RnasedH2O中，吹吸几回，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保留备用。

（8）抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。

于厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：

A260/280ratio<。

（9）分离组织10mg（纯组织）加800ulTrizol试剂。

（10）扩增产物的鉴定。

DEPC处置方式如下：

1.DEPC处置：

（1）DEPC水：

100ml超纯水加入DEPC，充分混匀，高压灭菌。

（2）Tip头（枪头）、EP管等在提RNA进程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μlTip头;EP管和PCR反映管等）：

用%的DEPC水（1000ml超纯水加入1mlDEPC）37℃浸泡留宿，高压灭菌。

2.提取RNA，用DEPC水溶解。

3.RT：

我是用PCR仪来操纵温度和时刻的，因此RT是在PCR反映管中作的。

4.操作进程中要戴一次性手套，并常常换手套。

最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处置一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的%DEPC水，在灭菌就好了;此刻有入口的RNASEFREE的枪头买，直接用不用途理的。

如何排除污染：

机械运行完后，掏出PCR产物时不能随意抛弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。

（1）试剂：

mixer尽可能分装，不要原瓶多次取用。

（2）加样：

原那么是DNA最后加，其他试剂依照体积大小从大往小的加。

若是是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方式是算出整体积后加在一个管子里面，混合均匀以后再分装到各个管子里去，如此能够有效地幸免误差及污染。

另外，一般实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的确实是产物的开盖和质粒的稀释。

目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采纳了UNG来防污染。

Uracil-DNAN-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。

RNA定量：

RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面能够看看完整性。

至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。

RNA的贮藏，最要紧的是温度，-20不够，最好-80，液氮最保险。

mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的阻碍。

RT-PCR有两种做法：

条件具有的话可用kit进行一步法进行;假设条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。

两步法的结果加倍理想，条带特异性强且无拖尾现象，由此推测是体系加倍单一比较利于PCR的进行。

必然要做内参的，不作内参的结果是不可信的。

电泳能够不一路跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量mRNA的分离与纯化中。

步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNAPoly（A+）尾处的二级结构，使Poly（A+）尾充分暴露，从而提高Poly（A+）RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，不然会致使rRNA的污染。

因此此步骤不能省略。

下面，咱们介绍一个能够确认RNA溶液中有无残留的RNA酶的方式。

保温实验：

方式很简单的，依照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000ng的RNA加入至ml的离心管中，而且用的Tris缓冲液补充到10ul的整体积，然后密闭管盖。

把其中一份放入70℃的恒温水浴中，保温1h。

另一份放置在-20℃冰箱中保留1h。

时刻到了以后，掏出两份样本进行电泳。

电泳完成后，比较二者的电泳条带。

若是二者的条带一致或无明显不同（固然，它们的条带也要符合方式2中的条件），那么说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量专门好。

相反的，若是70℃保温的样本有明显的降解，那么说明RNA溶液中有RNA酶污染。

PCR污染与计谋：

PCR扩增产物污染.这是PCR反映中最要紧最多见的污染问题，因此，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。

还有一种容易轻忽，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较猛烈地摇动反映管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因此由其造成的污染是一个值得专门重视的问题。

1.标本处置区，包括扩增摸板的制备;

2.PCR扩增区，包括反映液的配制和PCR扩增;

3.产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。

各工作区要有必然的隔离，操作器材专用，要有必然的方向性。

如：

标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处置。

切记：

产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

利用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时刻暴露于空气中，幸免气溶胶的污染;

操作多份样品时，制备反映混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，如此即能够减少操作，幸免污染，又能够增加反映的精准度。

反映液污染

可采纳以下方式之一处置：

DNaseI法：

PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入DNaseI，室温反映30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。

该方式的优势是不需要明白污染DNA的序列;

尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：

由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段成效不行，而临床用于检测的PCR扩增片段一样为300bp左右，因此UNG的预防作用日趋受到重视和确信。

一、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全数都要用%DEPC水浸泡。

然后烘干，高压灭菌，再烘干。

二、用DEPC水洗事后固然不能用双蒸水洗了。

那你用DEPC处置还有什么意义呢?

还要用双蒸水洗吗?

3、玻璃器皿干烤：

180度，8小时或更长时刻;小器皿也能够用少量氯仿处置一下。

另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。