三种荧光定量PCR检测方式比较.docx

1、三种荧光定量PCR检测方式比较三种荧光定量PCR检测方式比较：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR进程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一样是在PCR扩增的指数期进行的。常见检测方式可分为以下几类：(1) SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光染料。其与双链 DNA 结合后， 荧光大大增强。因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，能够依照荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为 49

2、7nm，发射波长最大约为 520nm。PCR 扩增程序一样为 945572三步法，40 个循环。SYBR Green I 的缺点：由于 SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只若是双链就会结合发光，对 PCR 反映中的非特异性扩增或也会产生荧光，通常本底较高，因此在临床上利用可能会有假阳性发生。SYBR Green I 的优势：SYBR Green I 的优势是因为其缺点产生，由于它能所有的双链相结合，因此对不同模板不需专门定制不同的特异性探针，通用性较好，而且价钱相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中利用比较普遍。(2) 水解探针模式(man探针)TaqMan

3、探针是一种探针，荧光基团连接在探针的 5结尾， 而淬灭剂那么在 3结尾。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反映时，聚合酶的 5外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成绩伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积存。因此 Taqman 探针检测的是积存荧光。PCR 扩增程序一般是：9460 40 个循环。经常使用的荧光基团是 FAM，TET，VIC，HEX。(3)探针模式(Beacon、FRET)分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两头的核酸序列互补配对，因此标记在一

4、端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团牢牢靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一样为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补;茎一样 5-7 个核苷酸长，并彼此配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂那么标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，若是有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积存荧光。经常使

5、用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。PCR 扩增程序一般是：945572 三步法，40 个循环。FRET 探针又称双杂交探针，FRET 探针由两条相邻探针组成，在一条探针的 5端标记 FAM 荧光基团，另一探针的 3端标记 Red 640 荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM 基团和 Red640 基团相邻，激发 FAM 产生的荧光，作为 Red640 基团的激发光被吸收，使 Red640发出波长为 640 的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生 640 波长的荧光。由于 FRET 探针是靠近发光，因此检测信号是实时信号，非积存信号。经常使用的荧光基团是：LC-R

6、ed640，LC-Red705。能用于实时荧光 PCR 定量的方式很多，各有优缺点，应依如实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方式。下面为各类方式的比较：实验中的一些好适应：加入试剂之前，把它混匀一下，以避免放置时刻长了浓度不均;移液枪用完以后要归到最大计量的位置，避免久而久之弹簧失去弹性。必然要记着关水浴箱，切记切记;多和大伙儿讨论，同时多关注他人讨论的体会，这几乎是最快提高的捷径了;所有的试剂都自己配，出了问题才好找缘故。避免污染的方法：1. 所有的玻璃器皿均应在利用前于180的高温下干烤6h或更长时刻。2. 塑料器皿可用% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿侵蚀

7、，故不能利用)。3. 有机玻璃的等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用% DEPC，在37处置12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处置过的无菌双蒸水配制，然后经m滤膜。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验进程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用，所有器械等应为专用。经常使用的RNA酶：1. 焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一种强烈但不完全的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目

8、前被以为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，能够和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有必然抑制作用。因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA进程中不能利用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相

9、容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离取得全长的RNA。而实验失败的要紧缘故是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶可耐受多种处置而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染RNA酶最要紧的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反映,因此含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处置动植物总RNA提取-Trizol法：Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培育细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNas

10、e封阻分析和分子克隆。1. 将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品整体积不能超过所用Trizol体积的10%。2. 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手猛烈摇荡离心管15秒。3. 取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。4. 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4下7500g离心5分钟。5. 警惕弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过度，不然会降低R

11、NA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保留于-70。注意1. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步必然要警惕，靠近沉淀的部份必然要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，阻碍比值2. 加氯仿前的匀浆液可在-70保留一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保留一周，-20保留一年。总mRNA的提取体会：一、 关于Trizol Reagent需要的试剂1. Chloroform：氯仿(分析纯)2. Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)3. 75% Ethanol(in DEP

12、C-treated water)：75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用%的DEPC处置过的无Rnase的水稀释。4. RNase-free water：无Rnase的水。方式是：将DEPC按%(V/V)加在d H2O中500ml(50ul)，在37留宿，并高压灭菌即得(150 3小时)5. 一次性塑料手套6. 注意：DEPC有致癌之嫌二、 关于Trizol Reagent的利用进程：1. Homogenization(匀浆)a. Tissues：组织每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。b. Cells Grown in monolayer(单

13、层细胞接毒后显现病变的)针对JEV细胞总RNA的抽提法：BHK21细胞长成单层后，接毒(采纳大瓶)，37吸附1h，倒掉，加维持液(含2%的血清和HEPE8的MEM)约5ml，维持天。出 现75%-100%的病变时，以PBS(预冷)冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几回，以裂解细胞(细胞瓶有两 种经常使用规格：大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂别离约为和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶 底为度，而不是依据细胞的数量，不然可致使DNA的污染)具体方式如下：(样品必然要新鲜)(1) 组织接入预冷的EP管中，加入Tri

14、zol试剂1ml/10cm2(量必然要加足，不然易污染)，混匀，吹吸几回，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物完全分离。(2) 加氯仿(每1ml Trizol试剂加入氯仿，盖好，猛烈震荡15s，置室温2-3分钟。(3) 4离心，10000g15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包括在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。(4) 认真吸取上层水相，移至另一EP管中。(5) 加异丙醇，以沉淀RNA(每1ml Trizol试剂加入异丙醇)，置室温10min。(6) 4离心，10000g10min。RNA沉淀为一层如凝胶

15、样透明的小块附在管底和管壁。(7) 弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml(每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml)，震荡，充分洗涤沉淀，4离心，5500g5min。弃上清液，空气干燥(或真空干燥)后，沉淀重悬于无 Rnase dH2O中，吹吸几回，55-60作用10分钟以溶解RNA，-70保留备用。(8) 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。于厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio。(9) 分离组织10mg(纯组织)加800ul Trizol试剂

16、。(10) 扩增产物的鉴定。DEPC处置方式如下：1. DEPC处置：(1)DEPC水：100ml超纯水加入 DEPC，充分混匀，高压灭菌。(2)Tip头(枪头)、EP管等在提RNA进程中及做RT时接触RNA的器材(包括1ml、200l、20l Tip头;EP管和PCR反映管等)：用%的DEPC水(1000 ml超纯水加入1ml DEPC)37浸泡留宿，高压灭菌。2. 提取RNA，用DEPC水溶解。3. RT：我是用PCR仪来操纵温度和时刻的，因此RT是在PCR反映管中作的。4. 操作进程中要戴一次性手套，并常常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处置一下，枪头盒插好枪头后，加入1

17、-2ml的%DEPC水，在灭菌就好了;此刻有入口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用途理的。如何排除污染：机械运行完后，掏出PCR产物时不能随意抛弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。(1) 试剂：mixer尽可能分装，不要原瓶多次取用。(2)加样：原那么是DNA最后加，其他试剂依照体积大小从大往小的加。若是是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方式是算出整体积后加在一个管子里面，混合均匀以后再分装到各个管子里去，如此能够有效地幸免误差及污染。另外，一般实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的确实

18、是产物的开盖和质粒的稀释。目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采纳了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase(UNG)尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。RNA定量：RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面能够看看完整性。至于用分光光度计比较 不同标本之间就更不准了。RNA的贮藏，最要紧的是温度，-20不够，最好-80，液氮最保险。mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的阻碍。RT-PCR有两种做法：条件具有的话可用kit进行一步法进行;假设条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。两步法的结果加倍理想，条带特异性强且

19、无拖尾现象，由此推测是体系加倍单一比较利于PCR的进行。必然要做内参的，不作内参的结果是不可信的。电泳能够不一路跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量mRNA的分离与纯化中。步骤(4)中将RNA溶液置65中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结 合，不然会致使rRNA的污染。因此此步骤不能省略。下面，咱们介绍一个能够确认RNA溶液中有无残留的RNA酶的

20、方式。保温实验：方式很简单的，依照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至 ml的离心管中，而且用的Tris缓冲液补充到10 ul的整体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70的恒温水浴中，保温1 h。另一份放置在-20冰箱中保留1 h。时刻到了以后，掏出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较二者的电泳条带。若是二者的条带一致或无明显不同(固然，它们的条带也要符合方式2中的条件)， 那么说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量专门好。相反的，若是70保温的样本有明显的降解，那么说明RNA溶液中有RNA酶污染。PCR污染与计谋：PCR扩增产物污染.这是PCR反映中最要紧最

21、多见的污染问题，因此，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。还有一种容易轻忽，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较猛烈地摇动反映管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因此由其造成的污染是一个值得专门重视的问题。1. 标本处置区，包括扩增摸板的制备;2. PCR扩增区，包括反映液的配制和PCR扩增;3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有必然的隔离，操作器材专用，要有必然的方向性。如：标本制备PCR扩增产物分析产物处置。切记：产物分析区的产物及器材不要拿

22、到其他两个工作区。利用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时刻暴露于空气中，幸免气溶胶的污染;操作多份样品时，制备反映混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，如此即能够减少操作，幸免污染，又能够增加反映的精准度。反映液污染可采纳以下方式之一处置：DNase I法：PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入 DNase I，室温反映30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方式的优势是不需要明白污染DNA的序列;尿嘧啶糖苷酶(UNG)法：由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段成效不行，而临床用于检测的PCR扩增片段一样为300bp左右，因此UNG的预防作用日趋受到重视和确信。一、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全数都要用%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。二、用DEPC水洗事后固然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处置还有什么意义呢?还要用双蒸水洗吗?3、玻璃器皿干烤：180度，8小时或更长时刻;小器皿也能够用少量氯仿处置一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。