农业大学动物医学兽医格式新城疫RTPCR检测和毕业论文设计.docx
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农业大学动物医学兽医格式新城疫RTPCR检测和毕业论文设计
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安徽农业大学
毕业论文
题目：
新城疫RT-PCR检测和部分基因序列测定
姓名：
老男孩
学院：
动物医学院
专业：
兽医
班级：
2009级9班
学号：
指导教师：
++
2013年6月8日
目录
中文摘要………………………………………………………………………………1
Abstract………………………………………………………………………………2
引言……………………………………………………………………………………3
1材料与方法………………………………………………………………………5
1.1毒株与病料……………………………………………………………………5
1.2仪器和试剂……………………………………………………………………5
1.3引物……………………………………………………………………………5
1.4新城疫RT-PCR检测…………………………………………………………5
1.4.1核酸的提取…………………………………………………………………5
1.4.2反转录………………………………………………………………………5
1.4.3扩增NDV部分基因片段…………………………………………………6
1.5NDV部分基因片段序列测定…………………………………………………6
1.5.1NDV的增殖…………………………………………………………………6
1.5.2NDV部分基因片段扩增…………………………………………………7
1.5.3回收纯化RT-PCR产物……………………………………………………7
1.5.4构建重组表达质粒…………………………………………………………8
1.5.5制备感受态细胞……………………………………………………………8
1.5.6转化连接产物……………………………………………………………8
2结果与分析……………………………………………………………………8
2.1新城疫RT-PCR诊断结果……………………………………………………8
2.2NDV基因片段的RT-PCR扩增结果…………………………………………9
2.3NDV部分基因片段的测序结果……………………………………………10
3.0讨论……………………………………………………………………………11
4.0结论……………………………………………………………………………14
致谢………………………………………………………………………………15
参考文献……………………………………………………………………………16
新城疫RT-PCR检测和部分基因序列测定
兽医专业老男孩
指导教师++
摘要：
应用已经建立的新城疫病毒RT-PCR快速诊断技术，对由德国卡塞蒂非生物工程有限公司提供的疑似新城疫病毒感染的禽病料进行了检测，检测结果为阳性。
并对检测结果为阳性的病料进行鸡胚传代，对病毒进行增殖。
从鸡胚尿囊液中通过提核酸，反转录，PCR扩增分别扩增出2段基因片段，用1%琼脂糖胶电泳分析RT-PCR产物，构建重组表达载体，转化宿主菌，然后送由姜成康新有限公司进行基因测序。
序列分析显示所扩增的目的基因片段长度是2808bp和960bp，序列测定结果已经登陆到GenBank，登陆号为EU546165.2。
通过GenBank的Blast比对其与JL-1和LaSota株同源性相近，从部分序列上来看属于ClassIIgenotypeII。
关键词：
新城疫；RT-PCR；临床诊断；基因测序；
RT-PCRDetectionofNDandPartGene
SequenceAnalysisofNDV
StudentMajoringinVeterinarymedicinelaonanhai
Tutor++
Abstract：
TherapiddifferentialdiagnosistechniquefordetectionofNDVwasusedtodetectaclinicalsampleprovidedbytheBioengineeringCompany.Thepositivesamplewasdiagnosedbythegenesequencing.Extractnucleicacidfromthechickembryoallantois.ThroughreversetranscriptionandPCR,twogenesegmentsareamplifiedrespectively.ConducttheelectrophoreticanalysisofRT-PCRoutcomebyusingtheagarosegelof1%.Constructandrecombinetheexpressionvector,transformittothesendtoBiotechnologytoconductthegeneticsequencing.ComparisonofsequencingresultswiththeNCBIdatabasefoundthatthesetwogenefragmentsshowednosignificantvariation.AllthesequencesobtainedfromtheNDVisolatesweresubmittedtoGenBank，theaccessionnumberswereEU546165.2．Thesequenceanalysisshowedthatthelengthofthegenesegmentsamplifiedwere2808bpand960bp．Itis，以12000rmin离心10min，取离心后上清600μl，再加异丙醇800μl，颠倒混匀之后，放置于-20℃的环境条件下沉淀30min，以12000rmin离心10min，管盖的尾部要求必须朝向一致，要求向外，避免溶核算时核酸的丢失。
倾倒掉上清，将管口向下倒置于先前准备好的吸水纸上停留5-10S，沿离心管的管壁加入1000μl的75%冷乙醇（-20℃保存）冲洗1-2次，低速离心之后，将微量移液器的枪头置于核酸相反的位置用微量移液器吸出残余的液体，每个离心管吸取操作前必须换一个枪头。
1.4.2反转录
反转录体系为：
注射用水11μl
5×PCRBuffer（Mg2+free）4.0μl
dNTP（10mmolL）2.0μl
反转录酶M-MLV（200Uμl）1.0μl
酶抑制剂（Inhibiter）0.5μl
引物A（25pmolμl）0.75μl
引物B（25pmolμl）0.75μl
按以上试剂量配制20μl体系并震荡，低速离心混匀或用振荡器混匀，体系溶解核酸，低速离心后将体系放入42℃水浴锅内进行反转录1h。
1.4.3扩增NDV部分基因片段
PCR扩增体系为：
注射用水17μl
10×PCRBuffer（Mg2+free）3.0μl
dNTP（2.5mmolL）2.0μl
MgCl2（25mmolL）4μl
rTaqDNAPolymerase（5Uμl）0.5μl
引物A（25pmolμl）0.5μl
引物B（25pmolμl）0.5μl
反应条件为：
94℃条件下预变性5min；94℃条件下变性30S，55℃条件下退火40S，72℃条件下延伸1min30S，进行30个循环；72℃条件下终延伸10min。
将28μl体系加入Eppendorf管（200μl），加反转录产物2μl于管内并吹打，低速离心后放于PCR仪内进行扩增。
用1%琼脂糖胶电泳分析RT-PCR产物。
1.5NDV部分基因片段序列测定
1.5.1NDV的增殖
将研磨的鸡病料在-20℃环境下反复冻融3次，取病料上清按一定浓度稀释后接种到SPF鸡胚尿囊腔内孵育48-72h,收获鸡胚尿囊液,测定血凝效价。
取鸡胚尿囊液做血凝和血凝抑制试验检测病毒滴度。
1.5.2NDV部分基因片段扩增
取400μl的鸡胚尿囊液加600μl的裂解液，颠倒混匀大约10次后，加400μl的氯仿，加氯仿前先吹打几次，颠倒混匀大约10次后，置于-20℃环境条件下沉淀10min，以12000rmin的转速离心10min，取上清600μl，加异丙醇800μl，颠倒混匀后大约10次后，放置-20℃的环境条件下沉淀30min，以12000rmin的转速离心10min，要求管盖尾部必须朝向一致，要求一致向外，避免溶核算时发生核酸丢失。
倾倒去上清，将管口向下倒置于吸水纸上停留约5-10S，沿离心管内侧壁加入1000μl的75%冷乙醇（-20℃保存）冲洗1-2次，低速离心之后，将微量移液器的枪头置于核酸相反的位置用微量移液器吸出管内残余液体，每个离心管必须更换一个枪头。
按照新城疫RT-PCR检测中的步骤进行反转录和PCR扩增。
通过使用特异性引物扩增新城疫不同基因片段。
用1%琼脂糖胶电泳分析RT-PCR产物，并拍照记录电泳图片。
1.5.3回收纯化RT-PCR产物
具体操作按Biospin胶回收试剂盒说明书进行，步骤如下：
1）用锋利、干净的手术刀，将包含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放进1.5或2.0ml离心管中，称重。
2）按照1：
3的比例（凝胶质量的毫克数：
融胶液体积的微升数）向离心管内加入ExtractionBuffer。
3）于恒温金属浴或水浴中温育50℃，直到凝胶全部融化。
4）可选：
按1：
1的比例（凝胶质量的毫克数：
异丙醇的体积的微升数）加异丙醇，然后混匀。
5）将离心管内的所有混合液移入Spincolumn内，于6000g离心1min，然后丢弃接液管里的液体。
6）向Spincolumn内加入500μlExtractionBuffer，于12000g离心约30-60秒，并丢弃接液管里的液体。
7）向Spincolumn内加750μl的WashBuffer，于12000g离心约30-60秒，然后丢弃接液管里的液体。
8）再在12000g离心1min，并将Spincolumn转入无菌的1.5ml离心管里。
9）向Spincolumn中加入50μl的ElutionBuffer、水或TE溶液，在室温放置1分钟。
10）在12000g离心1min，在微量离心管的溶液内就包含目的DNA基因片段。
1.5.4构建重组表达质粒
酶切回收的目的基因片段，并与表达载体用连接酶连接。
整个操作过程均在冰浴上进行。
将连接体系混匀之后放置于16℃恒温水浴环境中反应8h即可用于转化。
1.5.5制备感受态细胞
用无菌铂丝从E.coli的LB平板上挑取一个2-3mm的单菌落，接到3mLLB液体培养基的试管中，于37℃150rpm振荡培养过夜。
次日取菌液100μl接种至含有5mL液体培养基的试管中，37℃扩大约培养2-3h至OD600nm值达到0.4-0.6。
取出试管冰浴10min菌液于无菌环境条件装入预冷过的数个1.5mL的Eppendorf管中，6000rpm离心5min。
离心之后弃掉上清液，控干多出的培养基之后，向里面加冰冷的CaCl2200μl，轻震使菌体悬起，冰浴30min。
6000rpm离心5min，弃掉上清，Eppendorf管倒着放到滤纸上面1min，加80μl冰冷的CaCl2使菌液重悬。
1.5.6转化连接产物
连接液取10μl全量转化80μl感受态的细菌，然后进行30min冰浴。
42℃环境条件下热休克90s，然后再进行冰水浴1min-3min。
每管加入800μl提前预热过的LB液体培养基，150rpm振荡条件下培养60min，使其抗性得到表达。
取出离心，每管内留下100μl菌液铺于含50μgmL氨苄青霉素的LB平板，室温条件下静置20-30min后37℃倒置培养12-16h，观察结果。
将阳性菌株送姜成康新有限公司测序。
2结果与分析
2.1新城疫RT-PCR检测结果
经1％琼脂糖凝胶电泳观察，鸡病料经裂解提核酸，RT-PCR扩增产物在700bp附近有一条与预计大小相符的条带。
图1鸡病料的PCR检测
M：
DNA标准DL2000；1：
NDV的RT-PCR产物
2.2NDV部分基因片段的RT-PCR扩增结果
利用NDV基因的特异性引物扩增出2条基因片段，大小分别约为960bp和2800bp，与设计的长度相符。
图2NDV部分基因片段的RT-PCR扩增结果
M：
DNA标准DL2000；1、2：
用不同引物扩增出的NDV基因片段
2.3NDV部分基因片段的测序结果
对上述RT-PCR产物进行新城疫部分基因片段序列测定，获得了2个基因片段序列，测序结果如下：
1号基因片段2808bp：
CGAGGGGTATTCGGGACAATGCTTGATGGTGTACAAGCAAGACTTAACCCTGCGTCTGCAGTATTCGATAGCACATCCCGCAGTCGCATTACTCGAGTGAGTTCAAGCAGTACCAAAGCAGCATACACAACATCAACTTGTTTTAAAGTGGTCAAGACTAATAAGACCTATTGTCTCAGCATTGCTGAAATATCTAATACTCTCTTCGGAGAATTCAGAATCGTCCCGTTACTAGTTGAGATCCTCAAAGATGACGGGGTTAGAGAAGCCAGGTCTGGCTAGTTGAGTCAATTATAAAGGAGTTGGAAAGATGGCATTGTATCACCTATCTTCTGCGACATCAAGAATCAAACCGAATGCCGGCGCGTGCTCGAATTCCATGTTGCCAGTTGACCACAATCAGCCAGTGCTCATGCGATCAGATTAAGCCTTGTCAATAGTCTCTTGATTAAGAAAAAATGTAAGTGGCAATGAGATACAAGGCAAAACAGCTCATGGTAAATAATACGGGTAGGACATGGCGAGCTCCGGTCCTGAAAGGGCAGAGCATCAGATTATCCTACCAGAGTCACACCTGTCTTCACCATTGGTCAAGCACAAACTACTCTATTACTGGAAATTAACTGGGCTACCGCTTCCTGATGAATGTGACTTCGACCACCTCATTCTCAGCCGACAATGGAAAAAAATACTTGAATCGGCCTCTCCTGATACTGAGAGAATGATAAAACTCGGAAGGGCAGTACACCAAACTCTTAACCACAATTCCAGAATAACCGGAGTGCTCCACCCCAGGTGTTTAGAAGAACTGGCTAATATTGAGGTCCCAGATTCAACCAACAAATTTCGGAAGATTGAGAAGAAGATCCAAATTCACAACACGAGATATGGAGAACTGTTCACAAGGCTGTGTACGCATATAGAGAAGAAACTGCTGGGGTCATCTTGGTCTAACAATGTCCCCCGGTCAGAGGAGTTCAGCAGCATCCGTACGGATCCGGCATTCTGGTTTCACTCAAAATGGTCCACAGCCAAGTTTGCATGGCTCCATATAAAACAGATCCAGAGGCATCTGATGGTGGCAGCTAGGACAAGGTCTGCGGCCAACAAATTGGTGATGCTAACCCATAAGGTAGGCCAAGTCTTTGTCACTCCTGAACTTGTCGTTGTGACGCATACGAATGAGAACAAGTTCACATGTCTTACCCAGGAACTTGTATTGATGTATGCAGATATGATGGAGGGCAGAGATATGGTCAACATAATATCAACCACGGCGGTGCATCTCAGAAGCTTATCAGAGAAAATTGATGACATTTTGCGGTTAATAGACGCTCTGGCAAAAGACTTGGGTAATCAAGTCTACGATGTTGTATCACTAATGGAGGGATTTGCATACGGAGCTGTCCAGCTACTCGAGCCGTCAGGTACATTTGCAGGAGATTTCTTCGCATTCAACCTGCAGGAGCTTAAAGACATTCTAATTGGCCTCCTCCCCAATGATATAGCAGAATCCGTGACTCATGCAATCGCTACTGTATTCTCTGGTTTAGAACAGAATCAAGCAGCTGAGATGTTGTGTCTGTTGCGTCTGTGGGGTCACCCACTGCTTGAGTCCCGTATTGCAGCAAAGGCAGTCAGGAGCCAAATGTGCGCACCGAAAATGGTAGACTTTGATATGATCCTTCAGGTACTGTCTTTCTTCAAGGGAACAATCATCAACGGGTACAGAAAGAAGAATGCAGGTGTGTGGCCGCGAGTCAAAGTGGATACAATATATGGGAAGGTCATTGGGCAACTACATGCAGATTCAGCAGAGATTTCACACGATATCATGTTGAGAGAGTATAAGAGTTTATCTGCACTTGAATTTGAGCCATGTATAGAATATGACCCTGTCACCAACCTGAGCATGTTCCTAAAAGACAAGGCAATCGCACACCCCAACGATAATTGGCTTGCCTCGTTTAGGCGGAACCTTCTCTCCGAAGACCAAAAGAAACATGTAAAAGAAGCAACTTCGACTAATCGCCTCTTGATAGAGTTTTTAGAGTCAAATGATTTTGATCCATATAAAGAGATGGAATATCTGACGACCCTTGAGTACCTTAGAGATGACAATGTGGCAGTATCATACTCGCTCAAGGAGAAGGAAGTGAAAGTTAATGGACGGATCTTCGCTAAGCTGACAAAGAAGTTAAGGAACTGTCAGGTGATGGCGGAAGGGATCCTAGCCGATCAGATTGCACCTTTCTTTCAGGGAAATGGAGTCATTCAGGATAGCATATCCTTGACCAAGAGTATGCTAGCGATGAGTCAACTGTCTTTTAACAGCAATAAGAAACGTATCACTGACTGTAAAGAAAGAGTATCTTCAAACCGCAATCATGATCCGAAAAGCAAGAACCGTCGGAGAGTTGCAACCTTCATAACAACTGACCTGCAAAAGTACTGTCTTAATTGGAGATATCAGACAATCAAATTGTTCGCTCATGCCATCAATCAGCTGATGGGCCTACCTCACTTCTTCGAATGGATTCACCTAAGACTGATGGACACTACGATGTTCGTTGGAGACCCTTTCAATCCTCCAAGTGACCCTACTGACTGTGACCTCTCAAGAGTCCCTAATGATGACATATATATTGTCAGTGCCAGAGGGGGTATCGAAGGATTATGCCAGAAGCTATGGACGATGATCTCAA
2号基因片段960bp：
GCGAGTCAAAGTGGATACAATATATGGGAAGGTCATTGGGCAACTACATGCAGATTCAGCAGAGATTTCACACGATATCATGTTGAGAGAGTATAAGAGTTTATCTGCACTTGAATTTGAGCCATGTATAGAATATGACCCTGTCACCAACCTGAGCATGTTCCTAAAAGACAAGGCAATCGCACACCCCAACGATAATTGGCTTGCCTCGTTTAGGCGGAACCTTCTCTCCGAAGACCAAAAGAAACATGTAAAAGAAGCAACTTCGACTAATCGCCTCTTGATAGAGTTTTTAGAGTCAAATGATTTTGATCCATATAAAGAGATGGAATATCTGACGACCCTTGAGTACCTTAGAGATGACAATGTGGCAGTATCATACTCGCTCAAGGAGAAGGAAGTGAAAGTTAATGGACGGATCTTCGCTAAGCTGACAAAGAAGTTAAGGAACTGTCAGGTGATGGCGGAAGGGATCCTAGCCGATCAGATTGCACCTTTCTTTCAGGGAAATGGAGTCATTCAGGATAGCATATCCTTGACCAAGAGTATGCTAGCGATGAGTCAACTGTCTTTTAACAGCAATAAGAAACGTATCACTGACTGTAAAGAAAGAGTATCTTCAAACCGCAATCATGATCCGAAAAGCAAGAACCGTCGGAGAGTTGCAACCTTCATAACAACTGACCTGCAAAAGTACTGTCTTAATTGGAGATATCAGACAATCAAATTGTTCGCTCATGCCATCAATCAGCTGATGGGCCTACCTCACTTCTTCGAATGGATTCACCTAAGACTGATGGACACTACGATGTTCGTTGGAGACCCTTTCAATCCTCCAAGTGACCCTACTGACTGTGACCTCTCAAGAGTCCCTAATGATGACATATATATTGTCAGTGCCAGAGGGGGTATCGAAGGATTATGCCAGAAGCTATGGACGATGATCTCAA
所测序的两段基因，1号基因为新城疫基因组上largepolymeraseprotein即L基因上的部分序列，2号基因为新城疫基因组上largepolymeraseprotein即L基因上的部分序列和hemagglutinin-neuraminidase即HN基因上的部分序列。
通过GenBank的Blast比对后其与JL-1和LaSota株同源性相近，从部分序列上来看属于ClassIIgenotypeII。
3讨论
新城疫在很多国家和地区都有发生，本病是一种严重危害养禽业的传染病，给养禽业造成巨大的损失。
近年来，由于免疫程序不合理和疫苗质量，鸡群常以非典型症状发病，新城疫的RT-PCR鉴别诊断技术越来越多的被用于临床诊断。
新城疫在世界上经历过三次大流行：
第一次大流行发生于1926年起源于东南亚，后来波及到世界各地，导致这次大流行的毒株主要为基因Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型；第二次大流行发生于二十世纪六十年代末起源于中东，至1973年传播全世界，此次流行的毒株被证实主要为基因Ⅴ和Ⅵ型；第三次大流行发生于二十世纪七十年代末起源于中东，1981年传播到欧洲后迅速蔓延到世界各地，这次流行的毒株证实由鸽源的新城疫病毒所引起，基因型为Ⅵb[8]。
新城疫因发病急、致死率高，它的流行对养禽业带来巨大损失。
1991年，Jestin等首次将聚合酶链式反应（PCR）这一技术应用于新城疫的诊断和检测，但当时并不可以直接从病料中检测，更不能区分出毒株的强弱。
到1994年，Jestin等从组织匀浆中提取RNA，直接进行RT-PCR，最后成功地检测出
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