疏水相互作用层析和反相层析.docx
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疏水相互作用层析和反相层析
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简介………………………………………………………………………………………………………9第一章疏水相互作用层析的原理……………………………………………………………………12理论情况下的疏水相互作用层析……………………………………………………………………12水的作用………………………………………………………………………………………………12蛋白结构………………………………………………………………………………………………13可逆的相互作用………………………………………………………………………………………14疏水相互作用分离的步骤……………………………………………………………………………14分辨率…………………………………………………………………………………………………17柱效……………………………………………………………………………………………………18选择性…………………………………………………………………………………………………19第二章疏水相互作用的实践…………………………………………………………………………25简介……………………………………………………………………………………………………25纯化策略（CIPP）中的疏水相互作用层析…………………………………………………………25疏水相互作用分离的实际考虑………………………………………………………………………27筛选选择性……………………………………………………………………………………………30自动的疏水相互作用填料筛选，方法开发和优化…………………………………………………30手动介质筛选，方法开发和优化……………………………………………………………………31样品性质和配基的选择………………………………………………………………………………33盐的选择和缓冲液制备………………………………………………………………………………33柱子和填料准备………………………………………………………………………………………38样品制备………………………………………………………………………………………………38样品上样………………………………………………………………………………………………39样品上样量……………………………………………………………………………………………39样品体积………………………………………………………………………………………………40温度……………………………………………………………………………………………………40洗脱……………………………………………………………………………………………………41线性梯度洗脱…………………………………………………………………………………………41逐步洗脱………………………………………………………………………………………………42流速……………………………………………………………………………………………………35流速控制………………………………………………………………………………………………44洗涤和再平衡…………………………………………………………………………………………45分析结果和下一步……………………………………………………………………………………45规模化放大……………………………………………………………………………………………46仪器选择………………………………………………………………………………………………46
疏水相互作用层析介质的保养………………………………………………………………………47问题解决………………………………………………………………………………………………47理想的疏水相互作用分离：
目的蛋白可以用梯度洗脱很好的分离………………………………47目的蛋白在梯度里很早洗脱，分辨率差……………………………………………………………47目的蛋白在梯度的末端洗脱，分辨率差……………………………………………………………48目的蛋白在梯度的中间洗脱，分辨率差……………………………………………………………48BioPress填料-专为生产设计的填料…………………………………………………………………52客户定制的填料………………………………………………………………………………………52客户定制产品…………………………………………………………………………………………52第3章疏水相互作用层析的介质……………………………………………………………………53简介……………………………………………………………………………………………………53SOURCE：
用高分辨率纯化和简单放大……………………………………………………………53纯化选项………………………………………………………………………………………………54纯化案例………………………………………………………………………………………………56进行一次分离…………………………………………………………………………………………58第一次使用或长期储存后使用………………………………………………………………………59用梯度洗脱分离………………………………………………………………………………………59用逐步洗脱分离………………………………………………………………………………………59清洗……………………………………………………………………………………………………60填料性质………………………………………………………………………………………………60化学稳定性……………………………………………………………………………………………61保存……………………………………………………………………………………………………61SepharoseHighPerformance：
高分辨纯化…………………………………………………………61纯化选择………………………………………………………………………………………………62纯化案例………………………………………………………………………………………………64进行一次分离…………………………………………………………………………………………65第一次使用或长期储存后使用………………………………………………………………………66用梯度洗脱分离………………………………………………………………………………………67用逐步洗脱分离………………………………………………………………………………………67清洗……………………………………………………………………………………………………67填料性质………………………………………………………………………………………………68化学稳定性……………………………………………………………………………………………69保存……………………………………………………………………………………………………69SepharoseFastFlow：
用高分辨纯化，简单放大…………………………………………………69纯化选择………………………………………………………………………………………………70纯化案例………………………………………………………………………………………………72
进行一次分离…………………………………………………………………………………………75第一次使用或长期储存后使用………………………………………………………………………76用梯度洗脱分离………………………………………………………………………………………77用逐步洗脱分离………………………………………………………………………………………77清洗……………………………………………………………………………………………………77填料性质………………………………………………………………………………………………78化学稳定性……………………………………………………………………………………………78保存……………………………………………………………………………………………………79第四章纯化策略中的疏水相互作用层析……………………………………………………………79应用CIPP………………………………………………………………………………………………80纯化技术的选择和组合………………………………………………………………………………80疏水相互作用层析作为捕获步骤……………………………………………………………………82纯化重组人表皮生长因子（h-EGF）………………………………………………………………83用于中度纯化的疏水相互作用层析…………………………………………………………………84纯化Fab片段…………………………………………………………………………………………85疏水相互作用层析作为精细纯化……………………………………………………………………86纯化重组的PseudomonasaeruginosaexotoxinA，PE553D………………………………………86用作精细纯化的其它技术……………………………………………………………………………88第五章反相层析：
原理和方法………………………………………………………………………89简介……………………………………………………………………………………………………89术语……………………………………………………………………………………………………92反相层析理论…………………………………………………………………………………………90反相层析分离的步骤…………………………………………………………………………………91分辨率…………………………………………………………………………………………………93选择性…………………………………………………………………………………………………95反相层析的实践………………………………………………………………………………………103填料和柱子选择………………………………………………………………………………………103洗脱液选择和准备……………………………………………………………………………………104柱子和填料准备………………………………………………………………………………………107样品制备………………………………………………………………………………………………107样品上样量……………………………………………………………………………………………108样品体积………………………………………………………………………………………………108温度……………………………………………………………………………………………………108洗涤和再平衡…………………………………………………………………………………………110问题解决………………………………………………………………………………………………110鬼峰……………………………………………………………………………………………………110
基线漂移：
平衡洗脱液………………………………………………………………………………110纯化选项CC2/C18:
对复杂样品的高分辨分离………………………………………………………113使用μRPC……………………………………………………………………………………………113分离案例……………………………………………………………………………………………114进行分离……………………………………………………………………………………………115第一次使用或长期储存后使用……………………………………………………………………115用梯度洗脱分离……………………………………………………………………………………115清洁…………………………………………………………………………………………………116填料性质……………………………………………………………………………………………117化学稳定性…………………………………………………………………………………………117储存…………………………………………………………………………………………………117SOURCE：
快速高分辨分离，简单规模化放大……………………………………………………117纯化选项……………………………………………………………………………………………118纯化案例……………………………………………………………………………………………118进行分离……………………………………………………………………………………………121第一次使用或长期储存后使用……………………………………………………………………121用梯度洗脱分离……………………………………………………………………………………122清洗…………………………………………………………………………………………………122填料性质……………………………………………………………………………………………123化学稳定性…………………………………………………………………………………………124储存…………………………………………………………………………………………………124反相层析和CIP………………………………………………………………………………………124反相层析作为捕获步骤……………………………………………………………………………125反相层析作为中度纯化……………………………………………………………………………125反相层析作为精细纯化……………………………………………………………………………125附录1样品制备……………………………………………………………………………………126样品的稳定性………………………………………………………………………………………126样品净化……………………………………………………………………………………………127特定的样品制备步骤………………………………………………………………………………128蛋白沉淀的重新溶解………………………………………………………………………………131更换缓冲液和脱盐…………………………………………………………………………………132除去脂蛋白…………………………………………………………………………………………135除去酚红……………………………………………………………………………………………135除去小分子量杂质…………………………………………………………………………………135附录2填充和制备柱子……………………………………………………………………………136选择柱子……………………………………………………………………………………………137
柱子填充和柱效……………………………………………………………………………………137
附录3选择纯化设备………………………………………………………………………………139直线流速（cm/h）和体积流速（ml/min）之间的相互转换………………………………………140从直线速度（cm/h）到体积流速（ml/min）………………………………………………………140从体积流速（ml/min）到直线速度（cm/h）………………………………………………………140从ml/min到使用注射器………………………………………………………………………………141附录4换算数据：
蛋白、柱压………………………………………………………………………141柱压…………………………………………………………………………………………………141附录5氨基酸表……………………………………………………………………………………142附录6纯化过程中的分析检测……………………………………………………………………144附录7生物样品的保存……………………………………………………………………………146
简介
如图1所示，根据生物分子的不同特性，可以用层析技术分离开。
疏水相互作用层析（HIC）在相对温和的条件下根据生物分子疏水性的不同而分离它们。
性质
方法
疏水性
疏水相互作用层析（HIC）
反相层析（RPC）
电荷
离子交换层析（IEX）
大小
凝胶过滤（GF），也称排阻层析
生物识别（配基特异性）
亲和层析（AC）
HydrophobicinteractionReversedphaseIonexchangeGelfiltrationAffinity
图1层析纯化的分离原理。
疏水相互作用层析作为对其它根据蛋白电荷、大小、生物特异性识别等来进行分离的方法的有效补充，广泛的用于蛋白纯化。
这种技术是样品进行硫酸铵沉淀后理想的下游纯化步骤（硫酸铵沉淀经常用于起始步骤样品的浓缩和清洁）或者是在离子交换层析后的进行下游纯化。
在这两种情况下，样品都包含高浓度的盐，可以不经过或经过很少的处理，直接上样到疏水层析柱上。
高浓度的盐增强了样品中疏水组分和层析介质的相互作用。
在分离过程中，样品被纯化，并被分别以小体积洗脱下来，因此，浓缩了样品以便直接上样到凝胶过滤层析，或者在缓冲液交换后进行离子交换层析。
在纯化方案中，疏水相互作用层析可以用于捕获、中度纯化、精细纯化。
GE医疗集团的介质可以用于实验室小规模分离，乃至公斤级产品的生产。
这本手册描述了该技术的理论及实践，可以采用的介质，如何选择这些介质以及应用案例和最经常进行步骤的详细指导。
使用经验以及从多于40年的层析纯化中总结的许多小窍门能够指导新手和专家来用最新的层析介质获得最好可能的结果。
第五章讲述反相层析（RPC），一种既能提供最高分辨率分离也能适用于分析工作的技术，比如和质谱连用，进行鉴定和性质鉴别或进行产品纯度的检测。
反相层析也可以在纯化步骤中用于最终精细纯化，但是必须注意确保有机溶剂的存在不会影响生物活力的恢复或三级结构。
GE医疗集团提供广泛的预装柱和可立即使用的层析填料，也提供一系列手册。
这些手册涵盖了不同的技术，来确保纯化在任何实验室、任何规模下都是一个简单而有效的过程。
图例：
表明用来改进步骤的大体建议或在特殊情况下建议采取的措施。
表明必须采纳的建议，或当需要特别注意时给予警告。
高亮显示解决问题的建议，用来帮助分析和解决难题。
高亮显示化合物，缓冲液和仪器。
提供实验方案的大纲。
通用缩略语：
层析中：
A280nm，A214nm:
在指定波长的紫外吸收。
AC：
亲和层析。
CF：
层析聚焦。
CIPP：
捕获、中度纯化、精细纯化
CV：
柱体积GF：
凝胶过滤层析，有时也称为SEC（分子大小排阻层析）HIC：
疏水相互作用层析IEX：
离子交换层析，文献中也被记为IECMPa：
兆帕斯卡Mr：
相对分子量N/m：
用每米的理论塔板数目来表示的柱效pI：
等电点，蛋白具有零表面电荷时的pH值psi:
压强单位，磅每平方英寸RPC：
反相层析Rs：
分辨率，峰之间的分离度SDS：
十二烷磺酸钠
产品名称中的缩略语：
CIP：
在位清洗FF：
FastFlow，快流速HMW：
高分子量HP：
HighPerformance高效i.d.:
内径LMW：
低分子量PE：
PEEKST：
用不锈钢制作的柱子
第一章疏水相互作用层析的原理
本章提供一个对疏水相互作用层析（HIC）的简单介绍，主要讲述进行分离的基本原理。
进行分离的实际操作方面将在第二章涉及。
疏水相互作用层析根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白。
虽然可以在科学文献中找到一些建议，但是到目前为止，还没有被广泛接受的关于疏水相互作用层析机制的理论。
图2显示分子表面带有不同程度的疏水性的标准蛋白是如何被分离的。
运行所用缓冲液中的某种盐的存在会显著影响疏水蛋白和疏水层析介质的相互作用。
高浓度的盐会增强相互作用，而低浓度的盐减弱相互作用。
在本例中，所有单个蛋白都和疏水相互作用层析介质的疏水表面相互作用，但是，随着缓冲液中里子强度的降低，相互作用逆转了，具有最低程度疏水性的蛋白最先被洗脱。
具有最强相互作用的蛋白最后被洗脱，这需要盐浓度降得更低来逆转相互作用。
CytochromecRNAseALysozyme¢-chymotrypsin
Yellow:
hydrophobicresidues
Proteinsseparatedinorderofincreasingsurfacehydrophobicity
Column:
PhenylSepharoseHighPerformancepackedinTricorn10/100columnSample:
Cytochromec,RNAseA,lysozyme,¢-chymotrypsinStartbuffer:
1.7Mammoniumsulfate,0.02MTris-HCl,pH7.5Elutionbuffer:
0.02MTris-HCl,pH7.5Gradient:
0–100%elutionbufferin10CVFlow:
1ml/min,76cm/h
图2蛋白根据其表面疏水性（黄色表示疏水性氨基酸，红色表示亲水性氨基酸）的不同被分离，其中标准蛋白用PhenylSepharoseHighPerformance分离。
理论情况下的疏水相互作用层析
水的作用
对于极性物质来说，水是一个好的溶剂。
但是对于非极性的物质来说，是一个不好的溶剂。
在
液态水中，大部分水分子由于它们之间形成的氢键而成簇存在（图3）。
虽然水簇的半衰期非常短，其净效应是分子间非常强的黏附，这些可以从水的高沸点可以反映出来。
图3水的溶解性取决于它能够与偶极子作用并能形成氢键。
在空气-水的界面上，水分子自身排列成一中高度有序的壳层。
这里，形成氢键的可能性不再平衡，却主要由界面的液体方面来主导。
这导致一个高度有序的结构，体现在强的表面张力上。
任何影响水壳层稳定性的物质也都会影响表面张力。
当一个疏水物质，比如蛋白质或者疏水配基浸没在水中，类似于表面张力的现象就会发生。
水分子不能浸湿疏水物质的表面。
取而代之的是：
由于水分子们不能在所有的方向形成氢键，它们在物质的周围形成了一个高度有序的壳层。
使这个壳层最小化导致有序水数目的减少，那就是出现了一个热动力学上更加有利的情况：
熵增加了。
为了获得熵，疏水物质被强迫的融合在一起，来使这样的壳层总面积最小化。
这样，疏水相互作用依赖于水分子的性质而不是疏水分子的直接相
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