一请教关于水稻愈伤组织的问题.docx
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一请教关于水稻愈伤组织的问题
组培常见英汉对照
abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar（琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic（无菌的）auxin（生长素）axillarybud（腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellulartotipotency（细胞全能性）cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体）chromosomedoubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmichybrid,胞质杂种）cytokinin（细胞分裂素）cytoplasm（细胞质）degeneration（败育）dedifferentiation（脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid（二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate（除去）embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant（外植体）filterpaper（滤纸）gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质）globalembryo（球型胚）haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone（激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）invitro（体外）invivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）malesterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristemculture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物）nodculture（茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollenculture（花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplastfusion（原生质体融合）rapidpropagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility（自交不亲和）shoottip（茎尖）sodiumhypochlorite（NaClO）somaticembryo（体细胞胚）somatichybridization（体细胞杂交）somatichybrid（体细胞杂种）stem（茎）stemtipculture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）steriledistilledwater（蒸馏水）sterilization（消毒）stockplant（母株）subculture（继代）sucrose（蔗糖）terminalbud（顶芽）transfer（转移）viruseradication（脱毒）
常用缩略语
ABA（脱落酸）CM（椰子汁）CPW（细胞-原生质体清洗液）
DMSO（二甲基亚砜）IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚丁酸）
KT（激动素）NAA（萘乙酸）PEG（聚乙二醇）
LH（液氮）CH（水解酪蛋白）GA3（赤霉素）
一、请教关于水稻愈伤组织的问题:
我的水稻愈伤组织经过转化后，基本上不分化，听说TDZ能帮助分化，请问是用TDZ完全代替KT，还是按一定比例加入？
还有就是在分化过程中还需要再加入潮霉素和羧苄吗？
我用的水稻品系是台北309，以前的分化培养基为MS+0.5/l谷氨酰胺+0.5g/l脯氨酸+0.3g/l水解酪蛋白+2mg/lKT+0.5mg/l6BA+0.2mg/lNAA+300MG/L羧苄+50MG/L潮霉素。
请查阅华南农业大学杨跃生老师的两篇文章,发在水稻科学上的,上面介绍了二价铜离子在水稻离体培养中的作用
植物生理学学报，1998年第3期，水稻高效转化系统的建立
二、关于外植体消毒
我做蝴蝶兰的花梗培养，用如下三法消毒，均有较多染菌，请各位指教，谢谢！
方法一：
75%酒精30s，剥去腋芽包片，0.1%升汞10min，水洗，2%次氯酸钠20min，水洗接种。
方法二：
75%酒精30s，0.1%升汞15min，水洗，剥去腋芽包片，0.1%升汞8min，水洗接种。
方法三：
75%酒精30s，0.1%升汞20min，水洗直接接种。
你先用自来水冲洗半个小时，然后用上述方法一。
我不知道结果，我只是遇到一个老师曾经这样做
水稻组培中的问题及解决方法：
1、做愈伤组织培养是一定要用植物胶（phytagel）吗，可以用琼脂粉代替可以吗？
还有在一些文献里看到一个叫gelrite的东西，作用是不是也跟植物胶一样啊？
完全可以，就是没有phytagel外观漂亮。
而且在做分化培养时，琼脂粉的效果比phytagel还要好。
gelrite就是植物凝胶
我们实验室用的都是琼脂粉
有一种叫卡拉胶的效果也不错，比琼脂粉还要便宜些。
有一种叫卡拉胶的效果也不错，比琼脂粉还要便宜些。
2、我是用水稻的幼胚培养的愈伤，转化并共培养之后转移到筛选培养基上，已经好几天了，愈伤怎么越变越呈褐色了呢，是不是基因没转进去死啦？
急啊！
顺便问一下大家，构建好的载体导入农杆菌后都怎么做检测啊？
我就用菌液和抽的质粒做了PCR，同时还做了阳性和阴性对照，阴性对照是没有扩增出目的条带的。
这样可靠吗？
我农杆菌用的是卡那和利福平双抗性。
有人告诉我还要把从农杆菌抽的质粒回转E.coli，再抽质粒酶切检测。
可是我想，如果前面的PCR是因为被含有该载体的E,coli污染才做出来的，那么回转后酶切检测的结果不是也不可靠吗？
变黑是死了.一般转了以后我是先放20度三天,然后到28度再培养的.不过有时候我转的不好也会黑了,死掉.正常的话颜色是不会变的.本来转了以后就是一个筛选过程.
关于检测,你用你的agrobacterium的菌液做PCR就可以了,不用回接,麻烦的
3、谁有水稻成熟胚和幼胚愈伤组织培养的protocol啊
愈伤组织的培养其实就是培养基的配方问题吧。
我们采用的是成熟胚培养的，就是直接将成熟的水稻种子去壳后消毒播种到培养基上（有研究种子在培养基上斜插和平放对愈伤诱导影响的文章，你可以看一下，斜插是指胚端向外），大约10天左右在胚端长出愈伤组织，用手术刀切下（注意将一起长出的根切除干净），放到同样的培养基中进行培养，愈伤长大一些后进行继代培养，或直接可用于转基因的研究。
培养基的配方如下：
N6大量
B5微量
B5有机
MS铁盐
2.4-D终浓度2mg/L
L-脯氨酸500mg/L
谷氨酰胺500mg/L
水解酪蛋白300mg/L
蔗糖30g/L
胶8g/L
这种培养基我们称为NBD培养基，你可以在培养的过程中进行试验、摸索，不同的水稻品种的培养方法，培养基中的激素浓度都可能有不同，这方面的文献也很多，上网搜一下。
另外未成熟胚据说做起来更方便，只是我们这里条件不允许，你可以试试。
植物凝胶更利于细胞增值和胚的生长，更适合植物的生长的条件，琼脂的均一性相对来说要差一些，也可以用，但效果要差。
我们做的植物愈伤组织培养一直都是用的琼脂粉,感觉只要培养配方适合,愈伤长势也会很好,影响不大
4、共培养之后，用于清洗愈伤组织的无菌水中的头孢浓度和选择培养基中头孢的浓度多少最好啊
我上学期刚学做组织培养时做过两次，都是清洗后放到选择培养基后农杆菌又蔓延开了，有个师兄说选择培养基中的头孢应该浓度高点
请高手指点一二，还有用愈伤组织转基因还要注意些什么？
共转化后不用清洗就行，关键是抗生素种类和浓度，抑制农杆菌我们一直用羧苄，或者跟头孢一块儿用；如果菌很多要三天换一次培养基，直至无菌。
用愈伤做转化受体，诱导愈伤的时间长短及生长状态与再生有很大关系。
5、种子消毒
原来是先用酒精浸泡1min，后用20％NaClO浸泡30min，然后无菌水清洗，结果还是染菌了好多，怎么做才好呢？
还有，是用整粒种子培养好呢还是切掉一部分好？
种子的挑选很重要，一定要挑透明、成色很好的种子。
灭菌使用75％乙醇1min，0.15HgCl15mins，无菌水清洗。
关键是种子质量要好，要挑好种子做才行。
半粒米做可能会好一点，因为这样污染的几率就少了一半，不过我没试过。
如果种子质量好，就不用切了，好麻烦的。
其实挺好做的，祝你好运！
这个问题我也遇到过,后来发现是我的消毒液有问题,买一瓶新的试试看还有,不要忘记加点土温
在种子浸泡的时候加点洗涤剂，有利于浸泡充分，而且同样的，有时试剂过期了，消毒效果不好，最好再换一瓶试试，我也遇过同样的问题，换新的消毒液就好了
如果是用幼胚来做的话,先用70%-75%的酒精消毒1分钟,后用无菌水清洗一遍,然后再用2%NaClO浸泡30min.再用无菌水洗数遍直到干净,最后把放入虑皿把幼胚挑出来,即解剖种子,这样愈伤会长得好,而且可以大大减少污染率.我这样做几乎不污染.
严格要求每一步消毒步骤，包括工作台，器皿，高压灭菌的最好是先灭先用，不要用灭过菌方了很长时间的
用70~71%的酒精处理10~20秒,0.2%HgCl7~10分钟.无菌水清洗4~6遍,酒精不要处理太长,容易引起褐化.无菌水每次清洗1MIN左右.做之前种子要洗干净.无论是种子或是茎段,块根我都差不多用以上方法灭菌,一般不会污染.如果不成功的话,你应该考虑其他方面的原因了.祝你好运!
6、我做基因枪转化后恢复培养了一周左右的时间，之后筛选了两周的时间，请问大家现在是否可以做分化，请教各位水稻分化培养基的配方，另外希望好心人给提供较完整的分化流程，同时各位高手能否提供一些关于水稻组培方面的书，不胜感激！
7、现在有一个很严重的问题想请教做过水稻组培的前辈：
我现在做的实验水稻组培部分再生出现了问题，以前也看到别人在这里求助过同样的问题。
我的水稻愈伤组织再生一个多月没有反应，我的激素配方参考了一个博士的论文：
预分化激素浓度6-BA2mg/L，NAA0.1mg/L，ABA5mg/L，羧苄300mg/L，潮霉素50mg/L
分化激素浓度是KT2.5mg/L，NAA0.1mg/L，羧苄250mg/L，潮霉素50mg/L
我想问的是：
1我的愈伤组织经过了好多次继代，农杆菌转化后也经过了好多次筛选，是不是这样做对再生不利。
2我在做分化的时候，灯管很热，一般能达到34度（我都已经把空调调到16度了），这样由于存在温差我的瓶子上有很多水珠，这种状态是否对我的实验有很大影响
先谢谢
多次继代对发苗一定会有很大影响。
温度和湿度会有一定影响，但应该不会一棵苗也没有，应该不是主要原因。
另外还应该仔细问问各种培养基的配方，这些东西老师一般都不让写的台详细，毕竟都是半辈子才摸索出来的东西。
你的预分化和分化培养基的成分太简单了
分化一般都不加羧苄和潮霉素了，另外温度太高肯定不行
继代的次数太多是关键，只继一次的再生效果最优，其他因素都不重要。
如果第一次继代后就再生，你会发现，即使条件再恶劣，PGR配比有些出入都会分化得很好的。
8、水稻愈伤转化后多久才能长出抗性愈伤啊？
我是用水稻的幼胚培养的愈伤，转化并共培养之后转移到筛选培养基上，已经好几天了，愈伤怎么越变越呈褐色了呢，是不是基因没转进去死啦？
急啊！
顺便问一下大家，构建好的载体导入农杆菌后都怎么做检测啊？
我就用菌液和抽的质粒做了PCR，同时还做了阳性和阴性对照，阴性对照是没有扩增出目的条带的。
这样可靠吗？
我农杆菌用的是卡那和利福平双抗性。
有人告诉我还要把从农杆菌抽的质粒回转E.coli，再抽质粒酶切检测。
可是我想，如果前面的PCR是因为被含有该载体的E,coli污染才做出来的，那么回转后酶切检测的结果不是也不可靠吗？
刚转化后在筛选培养生长是会变褐。
因为你的大部分愈伤组织是没有转化的，在筛选培养基上（一般是潮霉素）未转化的愈伤组织会变褐，如果你的转化成
常现象，筛选的目的就是让大部分未转化的愈伤褐化死掉，转化成功的愈伤在20天左右会有新鲜的愈伤长出，然后再经1-2轮筛选就可分化了
9、水稻愈伤组织的分化与光照的关系
小第我在做水稻愈伤分化中遇到了点麻烦事情----用了很多种培养基都未能分化出植株来!
苦恼死我了^o^~~~~~~,
不知道是否是光照因素在作祟?
祈望有经验者能指点迷津!
谢谢!
水稻的愈伤组织的分化要考虑温度，一般在28度比较合适，还有高光强。
水稻再生技术已经成熟，可能还是你的培养基配方的问题。
10、现在我的水稻组培苗在培养瓶中，我想移栽到土里，现在不知道怎么练苗，在此求助练苗如何操作和步骤，先谢谢了（：
个人感觉水稻很好活，几乎不需要怎么炼苗，不过可能要视品种而定，炼苗的话就是在你种之前先把瓶子打开加一点水，放上两天。
之后把苗拿出来洗净培养基，然后我们是先水培几天，就是用一种方的容器，放入营养液，上面盖上硬塑料板，塑料板上有很多的小圆空，将水稻苗一棵棵用海棉包住根上面一点的茎的部分，种在小圆空里，记住营养液的pH值要在4.5－5.5之间，不能超过5.5，长的不好的话就要检测你的pH值是否合适了，生长上一周后，就可以拿出来种在土里的，当然一定要有水的。
那么，主要就是光照问题，水稻喜高光强，屋内阳光不能直射，光强不够。
移到外面就好了。
有两种方法：
1）有组培苗的培养瓶开口，培养基上覆水，约1cm，置于温室3天左右，然后移栽到土中；
2）先将组培苗水培半个月，水稻营养液要求pH5，参考倪晋山（1985）的配方。
待苗壮实后，移栽到土中。
参考文献
倪晋山。
1985。
植物生理学实验手册（薛应龙主编），上海科学技术出版社，63-64
我用的是第二种方法，效果很好，但比较烦，要经常换营养液。
我于2005年7月份通过组培获得了一批水稻苗，在移栽的前一天打开试管塞，然后在中午2点左右移栽到方便碗中，当然方便碗中的土已经和好，放在空旷的屋子里面，就是一间民房的堂屋，也就是客厅拉，光线很好，就是不能直接得到阳光的照射。
在移栽15天后，还不见苗长高，也不见生根，都无精打采，有的黄化，有的已经死了。
我赶快把这些方便碗移到屋外的屋檐下，过了10多天，可还是不见好转，只是有些壮苗还没有死掉。
移栽后每天下午我都浇少量的水，可不知道苗就这么死了。
当初之所以用组培的方法培养，就是因为种子少，万一不能通过自然发芽而成活，那就损失惨重，可结果还是都死了。
本来培养的苗长势很好，可移栽后居然。
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请有经验的战友能详细的讲解一下，好吗？
计是肥料太多了，或者是用了生肥，烧苗了。
重新去田间取土，再次移栽，移栽时可剪去部分叶子，以降低蒸腾。
方便碗是什么？
盛方便面的碗吗？
太小了，用市售的水桶吧。
另请注意水稻生长的最适温度是28度，喜光
因为我要做数量性状定位，一棵植株就是一个基因型，所以我用方便碗装。
方便碗就是我们在小餐馆吃饭，盛饭的碗啦！
方便碗里面的土没有施肥，没有加其他的肥料，所以还请大家能给点建议！
！
！
其实首先你应该注意的事你现在在南方还是北方。
在北方首先解决的是光照和温度。
光强低和15摄氏度以下水稻幼苗特别容易死亡。
如果没有这些条件，最好让苗待在无菌瓶中。
如果这两个条件解决了，就可以打开瓶口，瓶中加水，只要不把整个苗淹没就行。
1周后，看到培养基中有白色的较壮的根，就可以移栽了。
移栽后最好不要用水浸泡幼苗的基部。
等大了后，就可以了。
11、哪位师兄师姐做过水稻的组织培养实验,我最近在做这方面的实验.但是现在我遇到非常棘手的问题:
水稻愈伤组织得到了.因为我是在做转基因实验,我也通过基因方法把外源基因导入到水稻愈伤组织中,而接下来的愈伤组织分化实验中出现了问题.愈伤组织在分化培养基上不分化,我都已经做了快两个月了.真是愁死人了.我的分化培养基是:
MS培养基+2mg/LKT+0.2mg/LNAA.另外我还试了N6培养基+2mg/LKT+0.2mg/LNAA.同时加了筛选激素:
潮霉素.希望哪个师兄师姐帮帮忙.给我提些建议和意见.在次先谢谢了
细胞分裂素试一试TDZ，作一个TDZ的梯度，NAA的浓度不变
TDZ一般和BA、KT搭配使用效果会好些，当然不同的植物对不同的激素种类的敏感性是不同的，所以你要多试。
可以少加或者不加潮霉素
我们实验室用的水稻愈伤分化配方是MS+6-BA:
2mg/l+NAA:
0.2mg/l+Zeatin:
0.2mg/l+KT:
0.5mg/l，效果挺好的，你可以试一下。
12、Nitsch&Nitsch（1969）培养基
1.无机盐
KNO3950mg／L
NH4N03720mg／L
KH2PO468mg/L
CaCl2·2H2O166mg/L
MgSO4·7H2O185mg/L
FeSO4·7H2O27.8mg/L
Na2-EDTA37.3mg/L
MnSO4·4H2O25mg/L
H3BO310mg/L
ZnSO4·7H2O10mg/L
CuSO4·5H2O0.025mg/L
Na2MoO4·2H2O0.25mg/L
2.有机物
维生素H（生物素）0.05mg/L
肌醇100mg/L
维生素B10.5mg/L
烟酸5mg/L
维生素B60.5mg/L
甘氨酸2.0mg/L
叶酸5mg/L
蔗糖20g／L
13、组织培养中植物激素的ELIZA检测方法所用试剂盒在哪里买？
美国Agdia公司的产品：
1.AbscisicAcid（ABA）脱落酸检测试剂盒
2.DihydrozeatinRiboside（DHZR）DHZR检测试剂盒
3.Indole-3-aceticAcid（IAA）吲哚-3-乙酸检测试剂盒
4.Isopentenyladennosine（IPA）IPA检测试剂盒
5.Trans-ZeatinRiboside（t-ZR）转移玉米素糖甙检测试剂盒
竞争性酶联免疫方法，96次检测。
14、第一节 马铃薯的组织培养
马铃薯（Solanumtuberosum）是一种全球性的重要作物,适应性广,营养价值高，耐贮藏运输，成为一种重要的粮食作物之一，也是一种调节市场供应的重要蔬菜。
马铃薯原产拉丁美洲，当被发现可以食用后，很快传到世界各地，成为栽培很广的一种作物。
但是，发现从外地引种栽培1～2个周期后，明显发现产量降低，植株变矮，并有卷叶和花叶退化现象产生，这便是由于病毒引起的退化现象。
危害马铃薯的病毒有17种之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、奥古巴花叶病毒、纺缍形块茎病毒。
由于马铃薯是无性繁殖作物，病毒逐代积累，日益严重，引起严重退化。
马铃薯卷叶病毒和马铃薯Y病毒的一些株系，可使块茎产量减少50～80%。
法国Morel和他的同事们，1955年从患病马铃薯植株得到了无病植株，为治疗作物病毒开避了新途径。
一、马铃薯的形态特征和生物学特征
（一）马铃薯的形态特征
1．根 马铃薯的根系由初生根和匍匐根两部分组成。
初生根在块茎发芽后从基部发生，构成其主要吸收根系。
随着芽的伸长，陆续在芽的各个叶节处匍匐茎的两侧及下方发生匍匐根，水平生长。
2．茎 马铃薯的茎分地上和地下两部分，地上茎的主茎在形成16片叶子后，由花芽封顶，并在花的下部发生两个侧枝，从而构成马铃薯的主要同化系统。
地下茎包括主茎的地下部分、匍匐茎和块茎。
块茎与匍匐茎相连的一端叫薯尾或脐部，另一端叫薯顶，块茎表面分布着芽眼。
薯顶芽眼分布较密，发芽早，发芽势强，即具顶芽优势。
生产上的整薯播种、带着顶部芽眼切块，都是发挥顶芽优势的有效措施。
3．叶 马铃薯先出土的叶是初生叶，全缘，心脏形。
以后发生的叶为奇数羽状全裂单叶，在叶柄基部与主茎相连处着生有托叶。
4．花 马铃薯的花为聚伞花序，第一或第二花序开放，恰是块茎强盛膨大之时，此时是需要不断浇水的形态标志。
5．果实、种子 马铃薯果实为球形或椭圆形浆果。
种子小，扁平肾形。
种子可用来繁殖，但后代性状分离大。
（二）生物学特性
马铃薯性喜冷凉气候，不耐高温和霜冻，解除休眠的块茎4℃下发芽，发芽适温12～18℃。
地上茎叶生长适温17～21℃,25℃以上时生长不良，叶变小，超过30℃和7℃以下茎叶停止生长，－1℃时受冻。
块茎形成要求昼温14～24℃，夜温12～14℃，土温16～18℃。
土温20℃以上时块茎形成缓慢，而且容易引起退化，高温下养分多用于芽和匍匐茎生长而不易形成块茎，25～30℃时已经长成的块茎也会消失而变成细长茎。
结薯期要求12小时左右的短日照和松、湿润、肥沃及通气性良好的土壤条件。
土壤板结，薯块表面粗糙和薯形不正。
马铃薯生产中普遍存在有种性退化问题，表现为植株长势衰弱，株形矮化，分枝变少，薯块变小，产量逐年下降，造成退化的原因和学说多种，综合而言，主要是薯块生长锥细胞发生阶段性衰老而导致种性退化，而病毒和细菌病害的浸染，以及肥水、营养条件不良等都会加剧其退化程度。
二、马铃薯脱毒技术
马铃薯在营养繁殖时易受病毒的浸染，当条件适合时，病毒就会在植株内增殖，转运和积累于所结块茎中，随着世代传递，病毒危害逐年加重，一般可造成减产50%以上。
研究发现，有30多种病毒感染马铃薯，并引起品种退化，严重影响到马铃薯生产。
通过微茎尖组织培养技术能从马铃薯体内脱除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSV等病毒。
因此，采用组培技术，通过一定良种繁殖体系，生产优质种薯，是保证马铃薯高产、稳产的一项有效措施。
（一）脱毒种薯生产程序
采取微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用酶联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。
试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）。
用原原种在一定隔离条件下生产原种1代，以后逐级称为原种2代、良种1代、良种2代。
（二）茎尖培养脱毒
1．取材和培养
一般多采用在室内发芽，芽经热处理（38℃）2周。
然后取顶芽或侧芽的1cm的茎尖，在自来水下冲冼1小时左右，无菌条件下先用95%酒精迅速浸润组织，再用5%漂白粉溶液浸泡5～10min,然后用无菌水冲冼2～3次。
为了减少污染机会，可将块茎彻底消毒后，放在无菌容器培养，然后再去取茎尖。
分离茎尖时，把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可以留２个叶原基，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgIAA、0.1mgGA3、pH5.8。
也可White培养基，附加0.1～1mg/L的NAA和0.05mg/L的BA。
培养条件：
21～25℃、3000Lx、16h/d。
2．继代和生根
培养成功的马铃薯脱毒苗，经鉴定后，采用固体、液体培养基相结合方法扩繁。
取试管苗单节切段扦插在固体培养基上，每瓶可插20个左右茎段，经20天左右使可发育成5～10cm高小植株，可再进行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖5～8倍，试管苗多节接种在液体培养基上，进行浅层静止液体培养。
试验表明：
多节液体培养试管苗比固体培养基生根快，长
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