生物技术基因工程.docx

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生物技术基因工程

基因工程：

基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，是转基因生物获得新的遗传性状的操作。

基因工程的目标是实现受体生物性状的定向改造与改良。

载体:

在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工具。

克隆载体：

主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。

插入失活效应：

外源DNA克隆到插入型λ噬菌体会使噬菌体的某种生物功能丧失。

YAC:

人工染色体载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。

COS位点:

当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种黏性末端结合形成双链的区域称为cos位点。

α-互补:

是基于在两个不同缺陷的β-半乳糖苷酶片段之间可实现功能互补而建立的。

β-半乳糖苷酶（由1024AA组成）有两个主要的亚基：

α亚基和ω亚基，前者的DNA序列很短，后者比较长。

α与ω相结合就能表现出半乳糖苷酶活性。

多克隆位点:

含有紧密排列的多个限制性内切酶识别位点的一段DNA片段。

同位酶:

识别相同的序列但切割位点不一样的酶。

同尾酶:

来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。

同裂酶:

识别相同的核苷酸靶序列，且切割位点相同，形成同样的末端，这类酶特称为同裂酶。

星号活性：

在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，称为星号活性。

限制修饰系统：

是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。

探针：

带有能检测的标记物的DNA或RNA。

探针标记：

使DNA或RNA带上可检测的标记物的过程。

Southern杂交:

是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，用于外源基因整合的鉴定及分析。

Northern杂交:

是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。

Western杂交：

是利用抗原与抗体的特异结合的原理检测外源基因表达产物特异蛋白质的生成。

菌落原位杂交：

将菌落或噬菌斑转到固相膜上，原位裂解细胞后使核酸固定在膜上，然后与探针杂交。

生物芯片：

是将细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，通过微加工和微电子技术集中点在一个小的固体芯片表面，以实现对它们的准确、快速、大信息量的检测分析。

主要类型：

基因芯片、蛋白质芯片主要特点：

高通量、微型化、自动化。

基因芯片技术：

是将大量的探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布从而获得样品分子的数量和序列信息。

蛋白质芯片：

是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。

衔接物：

是指人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的双链寡核苷酸短片段。

转化：

一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。

转导:

通过噬菌体或病毒感染将外源DNA转入宿主细胞并使其产生新性状的过程。

转染:

把重组的噬菌体或病毒导入受体细胞的过程。

感受态：

作为受体细胞的细菌经一定处理（如冰冷的CaCl2溶液）后处于易于接受外源DNA的状态。

转化子：

经转化获得外源遗传物质/DNA的细胞。

转化率：

是每μg载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数，是衡量转化效率的重要指标。

基因文库：

来自某生物的不同DNA序列的总集，这些DNA序列都已被克隆进了载体以便于纯化、贮存与分析。

基因组文库：

是将某种生物细胞的整个基因组DNA切成适当长度的片段，连接在载体上，转化到宿主细胞中而构建的克隆总体。

cDNA文库：

是指将一种生物ｍRNA经反转录产生双链cDNA，以cDNA构建的克隆群体。

DNA接头分子：

在DNA的末端加上一段限制性内切酶的识别序列，随后用限制性内切酶切出所需要的粘性末端，使得DNA的平末端连接得以转变成为较易进行的粘性末端连接。

表达载体:

是可携带外源基因进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。

启动子：

RNA聚合酶识别和结合的一段DNA序列，位于基因的上游,是基因表达调控的重要顺式元件。

增强子：

是能够增强启动子转录活性的一段DNA序列，由多个元件组成，每一个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。

沉默子：

是参与基因表达负调控的一种元件（降低转录效率的一段DNA）终止子:

为转录提供终止信号的一段DNA序列，是基因表达的顺式负调控元件。

包含体：

是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

绝缘子：

既是基因表达的调控元件也是一种边界元件。

绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。

核基质结合区：

是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列。

信号肽：

指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列。

报告基因：

是用来筛选和指示转化细胞、组织和转基因植株的有效标记。

报告基因是提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段，它的应用不依赖于外界选择压力的存在。

卸甲载体：

将Ti质粒上的T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅保留其两边界即与T-DNA转移所必需的25bp序列而构建成的载体。

一元载体：

含目的DNA的中间表达载体与改造后的Ti质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体。

双元载体：

是指由两个分别含有T-DNA和vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。

共抑制:

是一种基因间相互作用引起的沉默现象。

当引入一个与植物内源基因有部分同源的DNA序列时，不但外源基因不能高效表达，反而抑制了内源基因的表达。

T-DNA区：

即转移DNA，能转移并整合在植物细胞核基因组上的、决定植物形成冠瘿瘤的一段DNA。

植物凝集素：

是一类具有特异性糖结合的活性蛋白，这是它们区别于其他植物蛋白的标志。

转基因动物：

指用人工的方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组整合，并随细胞的分裂而增殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。

ES细胞：

是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离出来的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，在适当的环境条件下它可形成胚系群落。

动物生物反应器：

从转基因动物体液或血液中收获基因产物即是动物生物反应器。

原病毒：

是指插入寄主细胞染色体并随细胞分裂分配到子代细胞中，而不损伤细胞状态的病毒。

基因治疗：

向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，达到治疗的目的方法。

病毒表达载体:

是以病毒基因组序列为基础，插入必要的表达元件所构建成的真核基因转移工具。

蛋白质工程：

基于对蛋白质结构和功能的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论或实践活动。

寡核苷酸介导的定点突变：

用含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。

重叠延伸PCR突变：

需1对内部突变引物和1对侧翼引物，需3次PCR反应，效率极高2个内部致突变引物与模板DNA的不同链配对，均含预突变。

大引物PCR定点突变：

需要3条寡核苷酸引物（包括两条外侧正向和反向引物以及内部突变引物），两轮PCR循环。

质粒的不相容性：

同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性。

盒式诱变：

用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。

基因剔除小鼠：

指特定的內源基因序列被剔除的工程小鼠。

简答题：

以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体？

改造的置换型噬菌体载体，重组人外源片段之后，总体积不能超过λ基因组的105％，不能少于λ基因组的75％。

以置换型λ噬菌体DNA作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA重组。

如果没有外源片段，仅是两臂连接，长度短于λ基因组的75％，不能被包入噬菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。

如果插入了外源片段后，总长度超过丸基因组105％后，也不能包入噬菌体颗粒，自然不能形成噬菌斑。

在重组DNA操作中为了提高连接效率常常将非互补的粘性末端修饰成平末端之后再进行连接。

请问将粘性末端变为平端的方法有哪些？

①S1核酸酶外切，降解单链DNA或RNA；②DNA聚合酶I（5'→3'合成补平）③T4DNA聚合酶同时具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性，可以用于将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平。

通过插入失活可以初步筛选重组子，但筛选到的克隆是否插入了正确的片段，还需要进一步的鉴定，鉴定的方法主要有哪几种？

一、载体表型选择法1.抗药性记号插入失活选择法2.β-半乳糖苷酶显色反应选择法二、根据插入序列的表型选择法三、凝胶电泳检测法四、PCR检测法五、核酸杂交检测法六、免疫化学检测法七、DNA序列分析1.Sanger双脱氧链终止法（酶法）2.Maxam-Gilbert（化学修饰法）3.DNA序列分析的（自动化）影响限制性内切核酸酶反应的因素:

1.酶的纯度：

不应存在其他的酶污染2.DNA的纯度3.DNA的甲基化程度4.酶切消化反应的温度5.DNA的分子结构6.限制性内切核酸酶的缓冲液7.星号活性克服星号活性的方法：

维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA样品的重新处理等。

作为克隆载体的条件：

1具有复制能力，在宿主细胞中的拷贝数较多;2带有可检测的遗传标记,能够赋予宿主细胞易于检测的表型;3具有克隆位点（合适的限制性内切酶位点）;4分子量较小，可接纳的外源DNA长度比较大;5在细胞内稳定性高。

目前常用的大肠杆菌表达载体pET28a的主要构件有T7噬菌体启动子、核糖体结合位点、His6标签序列、凝血酶切割位点、lacI等，请问这些构件的作用是什么？

：

T7噬菌体启动子、核糖体结合位点等引导目的基因高校转录和翻译；His6标签序列、凝血酶切割位点的作用是方便利用针对His6的螯合层析分离纯化蛋白，然后利用凝血酶切割去除标签蛋白。

lacI的作用是当目的蛋白对大肠杆菌有毒性时，可以通过添加诱导物，控制目的蛋白以较低水平表达。

转基因动物作为生物反应器有哪些特点？

原理是将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内制备转基因动物，并使外源基因在动物体内（乳汁、血液等）高效表达，然后在分离提取目的基因编码产物。

特点是：

表达产物能充分修饰且具有稳定生物活性，产品成本低，可进行大规模生产，产品质量高，可诱导分泌，易提纯。

基因组文库构建的基本步骤：

（1）高质量大Mr基因组DNA的分离制备

（2）基因组DNA的片段化：

1.RE对DNA分子的酶解（完全酶解；不完全酶解）2.DNA分子的物理剪切（超声波处理）（3）载体的制备（纯度高、去磷酸化效果好）（4）载体与DNA分子的重组连接（5）重组分子的转化或者包装侵染宿主细胞。

构建cDNA文库步骤：

（1）提取细胞总RNA，分离mRNA；

（2）逆转录合成cDNA第一链（dT引物或随机引物）；（3）RNaseH酶切，DNA聚合酶I合成cDNA第二链；（4）cDNA分子两端加上限制性内切酶位点的人工接头；（5）与载体相连，转化大肠杆菌。

基因组文库和cDNA文库的区别与应用：

1、两种文库都广泛应用于基因的分离与克隆2、cDNA文库具有时空特异性3、如果研究的目标不是表达的基因而是控制基因表达的调控元件或在mRNA分子中不存在的另外一些特定序列（如内含子），则只能选用基因组文库来研究。

在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA？

1.cDNA代表了基因组可转录部分，大大压缩了基因库中蛋白质表达基因。

2.cDNA不含内含子，可在E.coli中直接表达。

3.每类细胞