蛋白质药物的含量测定法吸收系数法消光系数法方法开发报告.docx

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蛋白质药物的含量测定法吸收系数法消光系数法方法开发报告

蛋白质含量测定法（吸收系数法）方法开发报告

类别

技术标准文件

文件编号

XXXXX

版本号

V00

页码

共页

生效日期

年月日（禁止复印）

审批页

—

起草人

审核人

批准人

部门

姓名

签名

日期

年月日

年月日

年月日

颁发部门：

质量保证部

分发部门：

存档

拷贝号：

NO./

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版本号

执行日期

变更原因、依据及变更内容

V00

/

新起草

1目的

对XX蛋白质含量测定方法（紫外吸收法）的消光系数进行研究，以期获得最适的消光系数，从而确保该方法科学、合理，检测结果准确并稳定可靠。

2范围

适用于XX蛋白质含量测定方法（紫外吸收法）的方法开发。

3定义

名称（缩略词）

释义

XX

Lowry法

福林酚法

Bradford法

考马斯亮蓝法

BSA

牛血清白蛋白

4环境、健康和安全

在本报告的开发过程中，会使用到强酸（如硫酸）、强碱（如氢氧化钠）及其它腐蚀性液体（如福林酚试剂），实验操作过程中应佩戴好手套与口罩，避免造成皮肤损伤；酸性、碱性废液应分别用碱、酸中和后再倾倒；腐蚀性液体切勿倒入下水道，应倒入废液桶，由专业部门回收。

在凯氏定氮实验过程中，会使用到高温设备（消化炉），实验操作过程中应佩戴好隔热防护手套，避免烫伤。

5培训

————

6职责

6.1质量保证部：

负责审核本方法开发报告。

6.2质量研究部：

负责起草本方法开发报告。

7程序（内容）

7.1概述

紫外吸收法测定蛋白质含量具有方法快速、方法稳定、结果准确的优点，其基本原理是依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，其在280nm波长处具有最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。

通过光谱扫描（扫描范围为400nm~240nm）可获得供试品的最大吸收峰波长及在最大吸收峰波长处的吸光度值，再根据供试品在最大吸收峰处的特定消光系数及样品稀释倍数，通过朗伯比尔定律可计算出供试品的蛋白质含量。

在紫外吸收法测定XX蛋白质含量实验中，关键实验参数为消光系数，所以在整个开发过程中对消光系数进行了摸索研究。

分别采用Edelhoch法、凯氏定氮法、Lowry法、凯氏定氮法、Bradford法对XX原液进行检测，最终确定以Bradford法对样品进行蛋白质定量，通过光谱扫描结果推导出样品在最大吸收峰（280nm）处的消光系数为XX[ml/（mg.cm）]。

7.2实验材料

7.2.1研究样品

名称

来源

批号

浓度

成分

XX原液

自制

X

X

X

X

外购

X

X

X

X

外购

X

X

X

X

外购

X

X

X

7.2.2标准物质

名称

来源

批号

浓度

成分

BSA对照品

自制

X

2.00mg/ml

含2.00mg/ml牛血清白蛋白

7.2.3主要试剂

试剂名称

规格/货号

批号

生产厂家

甘露醇

500g/瓶

F312A

广西南宁化学制药有限公司

一水合枸橼酸

500g/瓶

100820150802

湖南尔康制药股份有限公司

二水合枸橼酸钠

500g/瓶

001220150203

湖南尔康制药股份有限公司

聚山梨酯80

1L/瓶

K46413961524

MerckKGaA

盐酸

500ml/瓶

10062160304

湖南尔康制药股份有限公司

福林酚试剂

73104861

20160513

国药集团化学试剂有限公司

QuickStartTMBradford1XDyeReagent

500-0205

/

BIO-RAD

GuanidineHydrochloride

E424-5KG

/

Amresco

酒石酸钾

500g/瓶

20110501

成都市科龙化工试剂厂

硫酸铜

500g/瓶

20111025

成都市科龙化工试剂厂

无水碳酸钠

500g/瓶

20160516

国药集团化学试剂有限公司

氢氧化钠

500g/瓶

2015042301

成都市科龙化工试剂厂

灭菌注射用水

2ml/瓶

/

国药集团容生制药有限公司

7.2.4试药与试液

7.2.4.1超纯水：

电阻率不低于18.2MΩ·cm，本方法所有试液均用超纯水配制。

7.2.4.2XX原液缓冲液[10mmol/L枸橼酸（pH6.5）]：

称取1.92g一水合枸橼酸，加入约950ml超纯水溶解，用NaOH调节pH至6.5，再加超纯水至1000ml，混匀后用0.2μm滤膜过滤。

2~8℃保存6个月。

7.2.4.3XX制剂缓冲液：

称取0.07g一水合枸橼酸、23.20g甘露醇、0.10g聚山梨酯80、1.37g二水合枸橼酸钠，加超纯水溶解并稀释至500ml混匀后用0.2μm滤膜过滤。

2~8℃保存6个月。

7.2.4.40.1mol/l酒石酸钾溶液：

称取酒石酸钾23.53g，加水溶解并稀释至1000ml，混匀。

室温保存6个月。

7.2.4.50.04mol/l硫酸铜溶液：

称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）2.00g，加水溶解并稀释至200ml，混匀。

室温保存6个月。

7.2.4.64%碳酸钠溶液：

称取无水碳酸钠20.00g，加水溶解并稀释至500ml，混匀。

室温保存6个月。

7.2.4.70.8%氢氧化钠溶液：

称取氢氧化钠4.00g，加水溶解并稀释至500ml，混匀。

室温保存6个月。

7.2.4.8碱性硫酸铜溶液：

按照体积比为0.1mol/L酒石酸钾溶液：

0.04mol/L硫酸铜溶液：

4%碳酸钠溶液：

0.8%氢氧化钠溶液=1：

1：

50：

50。

临用前配制。

7.2.4.96mol/L盐酸胍：

称取盐酸胍5.73g，加水溶解并稀释至10ml，混匀。

7.2.4.10硫酸滴定液（0.5003mol/L）：

为商品化试剂,外购于深圳市博林达科技有限公司。

执行标准：

GB/T601-2002，生产批次20160511A，效期至20170511，标准物质编号GBW（E）081664。

7.2.5用具与耗材

名称

规格/型号

生产厂家

针头滤器

0.22μm

Sartorius

注射器

50ml

中国双鸽集团（上海聚民生物科技有限公司）

移液器

100μl、200μl、1000μl

Eppendorf

离心管

1.5ml、2.0ml、5.0ml

Eppendorf

玻璃试管

10ml

天津天玻科技发展有限公司

烧杯

500ml/1000ml

成都蜀牛科技有限公司

量筒

500ml/1000ml

成都蜀牛科技有限公司

容量瓶

500ml/1000ml

天津天玻科技发展有限公司

比色皿

石英，1ml，光径1cm

UNICO

比色皿

玻璃，3.5ml，光径1cm

UNICO

7.2.6仪器与设备

名称

规格/型号

生产厂家

紫外-可见分光光度计

Evolution201

Thermo

电子分析天平

BSA224S-CW

Sartorius

电子分析天平

BSA2202S

Sartorius

pH计

FE20

MettlerToledo

磁力搅拌器

MYP11-2A

上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司

涡旋混合仪

LABDANCERS25

IKA

离心机

Centrifuge5418

Eppendorf

水浴锅

DKB501S

上海精宏实验设备有限公司

凯氏定氮仪

AutokjeldhlUnitK-370

BUCHI

自动进样器

KjeisamplerK-376

BUCHI

消化炉

DigestAutomatK-438

BUCHI

质谱仪

TripieTOF5600

ABSCIEX

7.3实验人员

姓名

岗位名称

学历及专业

相关工作经验

X

X

X

X年

7.4操作步骤/技术路线

7.4.1预试验：

采用Edelhoch法检测XX原液的消光系数；采用多种蛋白质含量检测方法（如凯氏定氮法、Lowry法、Bradford法）对XX原液进行蛋白质含量测定，同时通过光谱扫描获得最大吸收波长处的吸光度，推算不同检测方法测得的消光系数。

通过后续试验评估几个消光系数计算方法的差异。

7.4.2消光系数计算方法的确定：

取三批原研药XXX，采用重量法稀释后进行光谱扫描，获得最大吸收峰波长处的吸光度，并采用以上几个消光系数计算XX的蛋白质含量，并通过理论含量（3.0mg/ml）计算为标示量的百分比。

选择为标示量的百分比在90.0%~110.0%范围内的所有检测方法，作为XX蛋白质含量测定的消光系数计算方法。

7.4.3用选定后的蛋白质含量消光系数计算方法，通过多次检测以计算消光系数，用所有消光系数的平均值作为XX样品的消光系数。

7.5过程及结果

7.5.1消光系数测定方法预试验

7.5.1.1Edelhoch法

取XX原液XX，置于10kD超滤中，用灭菌注射用水进行超滤置换，13000G/次，每次10min，共4次。

置换完成后，用灭菌注射用水和6mol/L盐酸胍分别稀释5倍、10倍、20倍、40倍、60倍、80倍。

在紫外分光光度下，分别测定280nm处的吸光度，计算每一个稀释倍数下样品在水环境中和6mol/L盐酸胍中的的吸光度比值。

参照文献《Howtomeasureandpredictthemolarabsorptioncoefficientofaprotein》，利用Eλ（6MG）=（#Trp）*5685+（#Tyr）*1285+（#Cys）*125可计算出样品在6mol/L盐酸胍中的摩尔消光系数，其中在XX样品中（#Trp）为10、（#Tyr）为20、（#Cys）为12，计算得Eλ（6MG）=84050。

下表中消光系数=Eλ（水）/Mr，Mr为XX的完整分子量，经质谱鉴定，XX原液XXX的完整分子量约XXXDa。

消光系数计算结果见下表。

表7.1Edelhoch法测定消光系数结果统计表

样品批号

稀释倍数

A280nm（水）

A280nm（6mol/L盐酸胍）

A280nm（水）/A280nm（6MG）

Eλ（水）

消光系数[ml/（mg.cm）]

消光系数

平均值[ml/（mg.cm）]

XXX

80

0.169

0.168

1.006

84550.3

XX

XXX

40

0.350

0.341

1.026

86268.3

XXX

20

0.684

0.650

1.052

88446.5

XXX

10

1.328

1.276

1.041

87475.2

XXX

5

2.262

2.015

1.123

94352.9

XXX

由上表结果可知，Edelhoch法测定XX样品在紫外最大吸收峰波长处的消光系数为XXX[ml/（mg.cm）]。

7.5.1.2凯氏定氮法

取XX原液XXX及原液缓冲液各1ml进行凯氏定氮测定，同时做一平行样。

在硫酸中经高温消化，水蒸气蒸馏，并用硫酸滴定液滴定，根据硫酸滴定液的消耗体积计算供试品溶液中氮含量。

依据公式蛋白质含量=（Vsanple-VBuffer）*14.01*0.5003*2*6.25÷100。

其中14.01为氮元素分子量，0.5003为硫酸滴定液浓度，2为硫酸滴定液中氢质子数目，6.25为一般蛋白样品平均含氮量的换算系数。

检测结果见下表。

备注：

凯氏定氮实验在XX省检验检测研究院生检室进行，试验中所使用的设备和试剂均为生检室所有；由于仅为借用设备资源和试剂资源，所以无委托协议书和正式检验报告书。

表7.2凯氏定氮法测定蛋白质含量结果统计表

样品批号

滴定液消耗体积（ml）

滴定液消耗体积平均值（ml）

滴定液消耗体积相对偏差（ml）

蛋白质含量（mg/ml）

XX原液XX

12.352

12.439

0.70%

XX

12.526

XX原液缓冲液

0.475

0.457

3.94%

/

0.439

由上表结果可知，凯氏定氮法测定XX原液Y20161107的蛋白质含量为XXmg/ml。

7.5.1.3福林酚法（Lowry法）

取XX原液XX，用水稀释80倍，做平行样，按《SOP-XXX蛋白质含量测定法（Lowry法）标准操作规程》进行检测。

检测结果见下表。

表7.3Lowry法测定蛋白质含量结果统计表

样品批号

稀释

倍数

实测值

（µg/mL）

蛋白质含量

（mg/mL）

蛋白质含量平均值

（mg/mL）

XXX

80

XX

XX

XXX

XXX

80

XXX

XXX

由上表结果可知，Lowry法测定XX原液Y20161107的蛋白质含量为XXXmg/ml。

7.5.1.4考马斯亮蓝法（Bradford法）

取XX原液XXX，用水稀释20倍，做平行样，按《SOP-QCXX0蛋白质含量测定法（Bradford法）标准操作规程》进行检测。

检测结果见下表。

表7.4Bradford法测定蛋白质含量结果统计表

样品批号

稀释

倍数

实测值

（mg/mL）

蛋白质含量

（mg/mL）

蛋白质含量平均值

（mg/mL）

XX

XX

XX

XX

XX

XX

XX

XXX

XX0

由上表结果可知，Bradford法测定XX原液XX的蛋白质含量为XXmg/ml。

7.5.1.5总吸光度测定（光谱扫描）

取XX原液XXX，用原液缓冲液以体积法稀释20倍，做平行样。

以原液缓冲液校零后在400nm~240nm进行光谱扫描，获得最大吸收峰波长处的吸光度。

检测结果见下表。

表7.5光谱扫描测定总吸光度结果统计表

样品批号

稀释倍数

最大吸收峰波长（nm）

最大吸收峰波长处吸光度

总吸光度

XX

20

279.880

0.711

14.28

279.893

0.717

由上表结果可知，光谱扫描测定XX原液Y20161107的在最大吸收峰波长处（280nm）的吸光度值为14.28。

7.5.1.6不同检测方法下消光系数

分别以凯氏定氮法、Lowry法、Bradford法测定的蛋白质含量为标准值，通过光谱扫描中总吸光度反推消光系数。

计算获得4个消光系数。

表7.6不同检测方法下消光系数结果统计表

检测方法

计算过程

消光系数[ml/（mg.cm）]

凯氏定氮法

XXX

XX

Lowry法

XXX

XX

Bradford法

XXXX

XX

Edelhoch法

/

XX

7.5.2消光系数计算方法选择

取三批XX原研药XX（XXX、XXXF、XXX），分别用制剂缓冲液按重量法稀释约7倍，同时做一平行样。

用制剂缓冲液校零后在400nm~240nm进行光谱扫描，获得最大吸收峰波长处的吸光度。

其中稀释倍数=[（样品重量+溶剂重量）÷样品重量]，稀释倍数乘以最大吸光波长处吸光度获得每1ml的总吸光度。

检测结果见下表。

表7.7不同检测方法下消光系数结果统计表

样品ID

样品重量（g）

溶剂重量（g）

λ（max）（nm）

A（λmax）处

吸光度

总吸光度（每ml）

总吸光度平均值（每ml）

XXXXX

0.1583

0.9805

280.179

0.742

5.338

5.3250

0.1578

0.9810

280.268

0.736

5.312

XXX

0.1581

0.9835

280.234

0.740

5.343

5.3405

0.1524

0.9838

280.159

0.716

5.338

XXX

0.1546

0.9839

280.403

0.719

5.295

5.2815

0.1528

0.9826

280.047

0.709

5.268

分别以表7.6中的消光系数，依据朗伯比尔定律计算Dulaglutide的蛋白质含量（比色皿光径为1cm），并计算为标示量的百分比（即回收率），其中三个批次XX的规格均为XXXmg/XXXml，即理论蛋白质含量为XXXmg/ml。

XXX的检测结果见下表。

表7.8不同检测方法下消光系数结果统计表

样品名称

XXXX

XXX

XXXX

凯氏定氮法

蛋白质含量（mg/ml）

3.92

3.93

3.88

为标示量的百分比

130.7%

131.0%

129.3%

Lowry法

蛋白质含量（mg/ml）

4.80

4.81

4.76

为标示量的百分比

160.0%

160.3%

158.7%

Bradford法

蛋白质含量（mg/ml）

2.99

3.00

2.97

为标示量的百分比

99.7%

100.0%

99.0%

Edelhoch法

蛋白质含量（mg/ml）

3.78

3.79

3.75

为标示量的百分比

126.0%

126.3%

125.0%

由上表可知，只有Bradford法测得XXX的蛋白质含量与标示量基本保持一致，在90.0%~110.0%范围内，其他方法测定结果与标示量差异较大。

XX作为XXX的类似药，其相似度较高，则XX与XXX的理论消光系数应无明显差异。

后续采用Bradford法对XX进行蛋白质含量定量，并计算XX的消光系数。

7.5.3消光系数确认

取XX原液XXX，采用Bradford法多次检测样品蛋白质含量（稀释采用重量法），并同时进行光谱扫描（400nm~240nm）测定最大吸收峰波长处吸光度，以光谱扫描下最大吸收峰处吸光度除以Bradford法检测结果计算得XX样品的消光系数。

三次实验共12个检测数据见下表。

表7.9XX消光系数检测结果统计表

样品名称

Amax

Bradford法检测结果（mg/ml）

消光系数[ml/（mg.cm）]

消光系数

平均值[ml/（mg.cm）]

消光系数

RSD

XXX

0.960

0.539

1.781

1.802

1.31%

XXX1-2

0.953

0.533

1.788

XXX1-3

0.955

0.531

1.798

XXX1-4

0.969

0.536

1.808

XXX1-5

0.946

0.521

1.816

XXX1-6

0.943

0.528

1.786

XXX1-7

0.977

0.545

1.793

XXX1-8

0.966

0.547

1.766

XXX1-9

0.977

0.544

1.796

XXX1-10

0.981

0.541

1.813

XXX1-11

0.974

0.524

1.859

XXX1-12

0.984

0.542

1.815

由上表可知，通过多次Bradford法及光谱扫描，测得XX样品的消光系数为XXXX[ml/（mg.cm）]，12次检测结果的RSD值为1.31%。

消光系数保留1位小数为XXX[ml/（mg.cm）]。

7.6结论

通过蛋白质含量检测方法的选择和消光系数确认，确定XX蛋白质测定方法（紫外吸收法）的消光系数为XXX[ml/（mg.cm）]，采用重量法进行样品的稀释。

7.7问题与讨论

7.7.1XX原液蛋白含量通常较高，所以原液与原液缓冲液的密度差异较大，重量法进行原液稀释时需考虑各自的密度。

7.7.2XX成品中因含有较高浓度的辅料（如46.4mg/ml甘露醇），而XX制剂的两个规格分别为XXmg/XXXml和XXXmg/XXXml，其蛋白质含量相对于制剂缓冲液来说较低，XX成品与制剂缓冲液的密度无明显差异，所以计算稀释倍数时不考虑成品和制剂缓冲液的密度差异。

7.7.3由于蛋白质样品存在光散射现象，蛋白质样品在最大吸收峰处的吸光度应扣除光散射值，即Afinal=Amax-A320nm，若A320nm为负则当作0。

统计上述多次光谱扫描图谱中Amax和A320nm，计算A320nm占Amax的百分比，计算结果见下表。

表7.10光散射确认结果统计表

样品名称

Amax

A320nm

A320nm/Amax

XX1-1

0.960

0.001

0.10%

XXX1-2

0.953

-0.002

-0.21%

XX1-3

0.955

-0.003

-0.31%

XXXXX1-4

0.969

0.000

0.00%

XXXXX1-5

0.946

0.003

0.32%

XXXXX1-6

0.943

0.004

0.42%

XXXXX1-7

0.977

0.003

0.31%

XXXXX1-8

0.966

-0.001

-0.10%

XXXXX1-9

0.977

-0.005

-0.51%

XXXXX1-10

0.981

-0.002

-0.20%

XXXXX1-11

0.974

-0.003

-0.31%

XXXXX1-12

0.984

0.000

0.00%

由上表结果可知，12次检测结果中，A320nm/Amax均小于0.5%，则光散射不干扰实验结果的准确性，所以计算蛋白质含量时Afinal=Amax。

7.8原始记录/数据索引

7.8.1实验记录

实验名称

实验记录本编号

XX蛋白质含量测定方法研究

XXX

XX原液（XXXXX）蛋白质含量测定（Bradford法）-第一次

XX

XX蛋白质含量测定消光系数确定-光谱扫描（第一次）

X

XX原液（XXXXX）蛋白质含量测定（Bradford法）-第二次

X

XX蛋白质含量测定消光系数确定-光谱扫描（第二次）

0X

XX蛋白质含量测定消光系数确定-光谱扫描（第三次）

0X

XX原液（XXXXX）蛋白质含量测定（Bradford法）-第三次

X

XX原研药蛋白质含量测定-消光系数确认

X

7.8.2电子数据

实验名称

保存路径

XX原液蛋白质含量测定方法研究

XX原液蛋白质含量测定方法研究

XX原液蛋白质含量测定方法研究

XX原液蛋白质含量测定方法研究

8相关文件

————

9参考文献

9.1张桂涛,阳勇,李庆昌,等.紫外法测定重组人红细胞生成素（Fc）融合蛋白的含量[J].中国医药指南,2015,13（10）:

65-66.

9.2PaceCN,VajdosF,FeeL,etal.Howtomeasureandpredictthemolarabsorptioncoefficientofaprotein[J].Proteinscience,1995,4（11）:

2411-2423.

10流程图

————

11附录

————