分子生物学教案模版.docx
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分子生物学教案模版
《分子生物学》教案
一、课程性质必修课
二、教学目的要求
分子生物学是一门近年来发展迅速并且在生命科学领域里应用越来越广泛、影响越来越深远的一个学科。
从学科角度来讲，分子生物学函盖面非常广，与生物化学和细胞生物学等生命科学主干课程有一些交叉。
在学习本课程之前，要求学生已掌握了必要的数、理、化知识，并学习了植物学、动物学、微生物学与生物化学等基础课程。
通过对本课程的学习，使学生掌握基因概念在分子水平上的发展与演变、基因的分子结构和特点、基因的复制、基因表达（在转录、翻译水平）的基本原理、基因表达调控的基本模式、基因发生突变与交换及DNA遗传多型性检测的分子生物学原理，了解新兴起的基因组学和后基因组学研究现状。
通过与实验课相结合，系统地介绍与基因克隆相关的DNA技术，使学生们掌握一些基本的分子生物学技术。
三、教材及有关参考书
朱玉贤等，《现代分子生物学》高等教育出版社，2002
BenjaminLewin编著余龙等主译，《GeneⅧ》科学出版社，2005
赵寿元等，《现代遗传学》高等教育出版社，2001
孙乃恩等，《分子遗传学》南京大学出版社，1990
四、适用专业
生物科学、生物技术、生物工程、科学教育等专业
五、授课学时
36学时
六、课程内容
第一章绪论
教学目的：
使学生对分子生物学的发展简史、分子生物学的研究内容及发展前景有较全面的了解。
教学重点、难点：
基因概念的发展与演变；对现代遗传学各发展阶段的认识。
课时安排：
4学时
教学内容：
一、什么是分子生物学？
分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。
二、分子生物学的发展简史
从1847年Schleiden和Schwann提出"细胞学说"，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对生物大分子--细胞的化学组成却有了深刻的认识。
孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而Morgan的基因学说则进一步将"性状"与"基因"相耦联，成为分子遗传学的奠基石。
Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。
在蛋白质化学方面，继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。
而Kendrew和Perutz利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。
总结与分子生物学相关的诺贝尔奖。
三、分子生物学的主要研究内容
1．DNA重组技术------基因工程
基因工程指将不同DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
DNA重组技术有着广阔的应用前景：
①在生物技术制药领域中的应用。
如：
利用基因工程技术改造传统的制药工业；利用克隆的基因表达生产有用的肽类和蛋白质药物或疫苗。
②定向改造某些生物的基因组结构，使它们具备某些特殊的经济价值。
③在基础研究中的应用。
如：
基因的克隆与分析；启动子分析。
2．基因表达调控
因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。
在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。
原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。
真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。
基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。
3．生物大分子结构功能----结构分子生物学
生物大分子的结构功能研究（又称结构分子生物学）一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能时，必须具备两个前提:
首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。
结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。
它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。
最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构，也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。
4．功能基因组学与生物信息学研究
先后完成了包括从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫等十余种模式生物基因组全序列的测定工作，并于2002年2月12日完成人类基因组测序工作。
世界两大最著名的学术刊物－nature和science同时发表了人类基因组全序列。
基因组测序工作的进展是非常令人振奋的。
但是也随之产生了新问题。
大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。
在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。
因此读懂基因组称为后基因组时代的生命科学领域面临的巨大的挑战。
在功能基因组时代，应用生物信息学方法，高通量地注释基因组所有编码产物的生物学功能是一个重要的特征。
生物信息学是在各种“组学”研究的推动下发展起来的.传统的研究方法是只研究某一个基因或蛋白质或转录产物，而“组学“的研究是采用高通量的技术分析细胞中全部的基因和蛋白质，这样势必会产生海量的信息，因此，人们必须寻求一种高速度、高效率、大规模的方式积累数据处理分析方法。
四、分子生物学展望
未来的发展方向：
不同模式生物基因调控网络的比较分析；RNA介导的基因表达调控网络；表观遗传（epigenetic）信息的整合；从数据整合到系统生物学（systemsbiology）。
第二章遗传的物质基础－DNA
教学目的：
使学生了解并掌握DNA的结构与功能
教学重点、难点：
DNA的一级结构的测定，DNA的二级结构及超螺旋结构。
课时安排：
4学时
教学内容：
第一节DNA的一级结构
一、一级结构的构成
所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。
核苷酸序列对DNA高级结构的形成有很大影响，如B-DNA中多聚（G-C）区易出现左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重复的DNA片段易出现发卡式结构等。
二、一级结构的序列测定
目前所用的DNA测序方法是在末端终止法的基础上发展起来的。
由英国科学家Sanger提出的。
Sanger在生物大分子的序列测定方面做出了杰出贡献。
他曾在1953年利用小片段重迭法成功测定了胰岛素51个氨基酸序列，并获得诺贝尔奖。
1977年又利用末端终止法测定了X174噬菌体得DNA序列，第二次获得诺贝尔奖。
末端终止法又称为双脱氧法，基本原理是模拟体内DNA的复制过程在体外合成DNA，通过测定DNA片段的相对长度来推断核苷酸序列。
至于成分大家不要死记，可以回忆一下DNA复制过程需要哪几种组分：
模板、dNTP、引物、DNA聚合酶，其中一种dNTP的磷酸基团用P32标记。
除此之外还需要每个管中分别加入一种ddNTP。
DDNTP是双脱氧核苷酸，由于在3位上缺少-OH，无法与下一个单体之间形成磷酸二酯键，因此，一旦掺入DNA链的延伸后，便终止DNA的合成这样，在DNA聚合酶的作用下核苷酸链不断延伸，我们可以调整dNTP和ddNTP的浓度，使ddNTP在每个位置上都有一个掺入的机会。
每个管都会产生一系列长短不一的DNA片段，其共同特征是末端的最后一个碱基是相同的。
我们将所得的所有DNA片段进行凝胶电泳，长度不同，泳动的速度不同。
8%-20%的聚丙烯酰胺可将相差一个碱基的DNA片段区分开，由于dCTP是放射性标记的，我们将凝胶放射自显影后，有DNA片段的位置就会显示出相应的信号带。
自下而上依次将碱基序列读出。
第二节DNA的二级结构
一、二级结构的特点
DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是：
1、DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的；
2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧；
3、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。
这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。
如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配对的碱基必定是G。
碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。
组成DNA分子的碱基虽然只有4种，它们的配对方式也只有A与T，C与G两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了DNA分子的多样性。
例如，某DNA分子的一条多核苷酸链有100个不同的碱基组成，它们的可能排列方式就是4100。
二、变性、复性及杂交
变性：
指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，只涉及次级键的破坏。
常用的DNA变性方法：
热变性和用变性剂处理。
如何判断DNA是否发生变性了呢？
常用的方法是测定DNA的光吸收值。
在碱基的嘌呤环和嘧啶环中存在共扼双键，在240－290nm波长有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm。
（蛋白质由于存在肽键，在280nm有明显的吸收峰）当DNA变性时，有序的碱基排列被破坏，光吸收值显著增加，该现象称为增色效应。
当缓慢增加DNA溶液的温度时，记录不同温度下的A260的数值，即绘制成DNA的变性曲线。
以温度为横坐标，以A260为纵坐标。
当A260增加到最大值的一半时，这时的温度称为DNA的溶解温度或熔点，Tm表示。
除此之外，光吸收法也是实验室定量测定DNA和RNA浓度和纯度的一种方法。
从某种样品中提取了基因组DNA，可根据A260/A280的比值判断其纯度。
复性：
变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。
杂交：
在退火条件下，带有互补核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的互补区段会形成双链结构。
分子杂交是分子生物学常用的技术，可用来检测某一特定基因的时空表达情况和在基因组中的。
分子杂交最初是由Southern设计出来的。
当时是用DNA探针检测的DNA，也就是DNA与DNA的杂交，人们就将这种方法称为是Southernblotting。
在此基础上，人们设计出DNA探针检测RNA，称为Northernblotting。
基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern 、northern）是一致的，都是探针和互补的靶基因结合，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。
基因芯片（DNAmicroarray）指将N个目的DNA用自动化设备点在固体支持物上，DNA经固化后，用不同颜色的荧光标记的探针对这些DNA同时进行杂交，根据杂交结果呈现的不同颜色，经计算机分析后得到关于N个基因表达情况的数据。
第三节DNA的高级结构
一、超螺旋结构及拓扑异构体
双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。
自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环（covalentlyclosedcircle,CCC）分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构（superhelix或supercoil）。
有些单链环形染色体（如φ×174）或双链线形染色体（如噬菌体入），在其生活周期的某一阶段，也必将其染色体变为超螺旋形式。
对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环（loop）结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。
超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。
真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。
研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。
二、拓扑异构变化的生物学意义
DNA拓扑异构的变化是DNA的复制和转录过程所必须的。
一个闭合的DNA分子可以用其连环数进行描述，连环数（Linkingnumber）是指一条链空间跨越另一条链的次数。
顺序相同的闭合DNA分子可能有不同的连环数，这反映了超螺旋程度的差异。
连环数不同的相同DNA分子称为拓扑异构体（Topologicalisomers）。
连环数由两个成分组成：
缠绕数（Writhingnumber,W）和扭转数（Twistingnumber,T）。
扭转数T是双链螺旋结构自身的一种性质，代表一条链绕另一条链旋转的双螺旋总圈数。
它由每一圈配对的碱基数决定。
对于平放在平面上的一个松弛的闭合环状DNA来说，用碱基对的总数除以每一圈的碱基对数就是它的扭转数。
缠绕数W代表双螺旋轴在空间上的弯曲，在直观上与超螺旋的概念相对应，但并非具有完全相同的数量上的定义或衡量。
对于一个松弛分子，W=0时连环数等于扭转数。
我们经常用下面的公式计算连环数的变化量：
ΔL=ΔW+ΔT
第三章染色体和基因
教学目的：
使学生掌握基因组的概念、原核生物基因组的特点和真核生物染色体及基因组特点。
教学重点、难点：
真核生物染色体的基本特征；卫星DNA及在分子标记中的应用；断裂基因；基因家族及串连重复基因簇。
课时安排：
4学时
教学内容：
第一节基因组大小与C值矛盾
一、基因组概念
一个物种单倍体的染色体的数目，称为基因组。
基因组中DNA的总量是物种所特有的，称为C值（C-value）。
C值的范围变化很大，从微生物中的<106到一些植物和两栖类的>1011。
图3.1总结了进化中不同门类生物的C值范围。
随着复杂度增加，每组中最小基因组大小也会随着增加。
三、C值矛盾现象
单倍体基因组DNA含量在低等真核生物中与形态复杂性有一定的正相关，但在高等真核生物中却非如此，它们的单倍体基因组DNA含量变化不定。
基因组大小与遗传复杂性并非线性相关，称为C值矛盾（Paradox）。
它涉及到真核基因组绝对和相对的DNA数量。
例如，蟾蜍Xenopus和人类基因组大小差不多，但是人类遗传发育上更为复杂。
在表面复杂程度相似的种属间（见图）也存在C值矛盾，这个问题局限于一些种族内，昆虫、两栖和植物最为明显。
在两栖中，最小的基因组<109bp，但是最大的基因组大约1011bp。
这些两栖类间的差别似乎并不需要基因间这么大的差别，表明在大的基因组中有非编码DNA的大量增加。
目前我们并不清楚为什么自然选择允许这些DNA的聚集（在其他种族中这种情况并不发生，基因组的分布是窄的。
鸟类、爬虫类和哺乳类只允许小的偏差，其差异在基因组大小两倍范围之内）。
第二节原核生物染色体及基因
原核生物的DNA与稀疏的蛋白质结合，存在于类核体上，没有核膜包被。
原核生物DNA分子小，基因排列紧密，空间利用率高。
1．功能上相关的几个结构基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点（启动子promoter、操纵子operator），在基因转录时协同动作，组成操纵元（operon）。
介绍乳糖操纵元的结构、调控机制。
2．绝大部分为编码基因，并通常以单拷贝形式存在。
3．重叠基因
第三节真核生物的染色体
一、染色体的基本组成单位－核小体
真核生物的染色体（chromasome）在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质（chromatin）的形式存在的。
核小体是构成染色质的基本结构单位，使得染色质中DNA、RNA和蛋白质组织成为一种致密的结构形式。
核小体由核心颗粒（coreparticle）和连接区DNA（linkerDNA）二部分组成，在电镜下可见其成捻珠状，前者包括组蛋白H2A，H2B，H3和H4各两分子构成的致密八聚体（又称核心组蛋白），以及缠绕其上一又四分之三圈长度为146bp的DNA链；后者包括两相邻核心颗粒间约60bp的连接DNA和位于连接区DNA上的组蛋白H1（见图），连接区使染色质纤维获得弹性。
核小体是DNA紧缩的第一阶段，在此基础上，DNA链进一步折叠成每圈六个核小体，直径30nm的纤维状结构，这种30nm纤维再扭曲成襻，许多襻环绕染色体骨架（Scaffold）形成棒状的染色体，最终压缩将近一万倍。
这样，才使每个染色体中几厘米长（如人染色体的DNA分子平均长度为4cm）的DNA分子容纳在直径数微米（如人细胞核的直径为6－7μm）的细胞核中。
二、染色体的基本特征－端粒、着丝粒
1．着丝粒
在有丝分裂中，姊妹染色单位向细胞相反的两极移动。
它们的运动依赖于染色体与微管（Microtubule）的接触，在另一端与极相连接（微管组成细胞的纤丝体系，在有丝分裂期间它们把染色体与细胞的极相连）。
在微管端部的两个区域连接着微管组织中心（Microtubuleorganizingcenters，MTOCs），它位于染色体中心粒附近和两个极上。
染色体上负责其在有丝分裂和减数分裂时分离的区域称为着丝粒
着丝粒的DNA顺序称为CEN顺序。
CEN区域中存在三种类型的序列元件（图）：
CDE-Ⅰ是所有中心粒左侧边界变化很少的9bp保守序列。
CDE-Ⅱ是所有中心粒中都存在的A?
T比例大于90%的80-90bp长序列，其功能依赖于其长度而非准确序列，其成份是一些真核生物中短的随机重复（卫星）DNA序列的遗迹，其碱基成分可能产生一些DNA双螺旋结构上的特征性的弯曲。
CDE-Ⅲ是所有中心粒右侧边界的11bp长的高度保守序列，此类元件的两侧序列保守性较低，对于中心粒功能可能是必需的（CDE-Ⅲ在侧翼序列必需的情况下可能长于11bp）。
2．端粒
通过断裂产生的染色体末端，会与其它染色体发生作用，然而天然染色体是稳定的，因此，染色体末端一定具有某种特殊结构，可以稳定染色体，该结构称为端粒。
我们可以用两个性质来定义端粒序列：
必需存在于染色体的端部（或至少在线性DNA分子的末端）；它必需赋予线性分子稳定性。
许多低等真核生物基因组中的线性DNA分子，其端粒结构都是已知的。
同样类型的序列也在植物和人类中发现，所以端粒的构建似乎遵循着普遍的规律。
每个端粒由一系列短的随机重复序列组成。
所有端粒序列能写成Cn（A/T）m的一般形式，其中n>1而m为1-4；3端具有单链尾，且富含GT。
端粒一方面可保护线性DNA免受核酸酶攻击，另一方面，利用用从头合成的方式加入重复，能抵消在染色体端部无法复制所导致的重复丢失。
讨论端粒与寿命的关系。
第四节真核生物的基因
一、真核生物基因组中包含非重复序列和重复序列
1．重复序列在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的40%－80%。
多为结构基因。
2．中度重复序列这类重复序列的重复次数在10－104之间，占总DNA的10%－40%。
各种rRNA、tRNA及组蛋白基因等都属这一类。
该类基因一般不编码。
3．高度重复序列——卫星DNA这类DNA只在真核生物中发现，占基因组的10%—60%，由6—100个碱基组成，在DNA链上串联重复几百万次。
由于碱基的组成不同，在CsCl密度梯度离心中易与其他DNA分开，形成含量较大的主峰及高度重复序列小峰，后者又称卫星区带（峰）。
该类基因一般不转录。
小卫星和微卫星序列是由比卫星序列的重复序列单位更短的单位构成，其重复单位的长度分别为10~100bp和10bp，而重复序列单位的数目通常为5~50个，不同个体间重复序列单位数目变化很大。
在人类中小卫星位点是1－5kb的顺序，此顺序由长15-100nt的重复单位组成。
当将人类的总DNA提出后，用限制性内切酶切成不同长度的片断（各种小卫星上都没有酶切位点），然后以小卫星DNA中的特异顺序为探针进行Southern杂交，可发现阳性片断的长度各不相同。
由于不同个体的这种串联重复的数目和位置都不相同，所以小卫星DNA的Southern杂交带谱就具有高度的个体特异性，人们就称其为DNA指纹分析技术（DNAfingerprints）。
二、断裂基因
大多数真核生物的基因（包括编码蛋白质、rRNA、tRNA的基因）由间隔的外显子（表现在最终RNA产物中的序列）和内含子（从初始转录物中去除的序列）组成。
“一条基因，一种蛋白质”应修正为“一种蛋白质，一条基因”。
因为一些DNA序列编码一种以上蛋白质。
三、基因家族与基因簇
真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样一组基因称为基因家族（genefamily）。
同一基因家族的不同成员紧密排列在一起，称为基因簇（genecluster）。
但更多情况下是散布在不同染色体上。
如：
珠蛋白基因α、β、γ、δ。
同一家族成员是由同一个祖先基因经过复制和变异传递下来的。
四、串连重复基因簇
串连重复基因出现在其产物被极度需要的情况下，如组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因。
如：
组蛋白基因，编码H1/H2A/H2B/H3/H4五种组蛋白的基因彼此靠近构成一个重复单位，这样的重复单位串连在一起。
rRNA基因，真核生物中的5.8S/18S/28SrRNA（主体rRNA）基因组成重复单位，转录出一个45SrRNA前体，然后通过转录后处理。
此外，还有，tRNA基因也是串连重复排列，但各重复单位中的各tRNA可以不同。
五、假基因
基因组中因突变而失活的基因，它和同一家族的活跃基因在结构和DNA序列上有相似性。
第三章DNA复制
教学目的：
使学生掌握DNA复制的机理及一般过程、复制的各阶段的主要生物学事件、复制的方式、复制的调控、DNA修复系统。
教学重点、难点：
复制的机理；复制的起始；端粒的复制。
课时安排：
6学时
教学内容：
第一节DNA复制的机理及一般过程
一、半保留复制
半保留复制：
Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。
1957年，梅塞尔和斯塔尔利用大肠杆菌（E．Coli）研究遗传物质DNA。
在这项经典实验中，他们先将大肠杆菌放入只含有既氮15（氮14的同位素）的营养基中培养，然后将这些大肠杆菌转移到只含氮14的营养基中。
提取不同培养代数细菌的DNA，用CsCl密度梯度离心。
实验结果表明：
在全部由15N标记的培养基中得到的15N-DNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。
当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是15N-DNA和14N-DNA的杂交分子。
第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N14N－DNA和14N14N-DNA。
随着以后在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱，离心结束后，从管底到管口，CsCl溶液密度分布从高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在与其相当的CsCl密度处，在紫外光下可以看到DNA分子形成的区带。
为了证实第一代杂交分子确实是一半15N-DNA－半14N－DNA，将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心，结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带（15N－DNA）及低密度带（14N－DNA）。
它们的实验只有用半
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