快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用.docx
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快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用
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植物生理与分子生物学学报,JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology2005,31（6:
559-5662005-01-10收到,2005-07-25接受。
快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用
李鹏民1,高辉远1*,RetoJ.Strasser2
（1山东农业大学植物科学系,泰安271018;2
BioenergeticsLaboratory,UniversityofGeneva,Jussy-Geneva,CH-1254,Switzerland
摘要:
JIP-测定（JIP-test是以生物膜能量流动为基础建立的分析方法。
利用该方法可以获得有关光系统II的大量信息。
文章介绍了快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的定义、数据分析方法及相关参数的意义,并举例说明如何利用该方法分析不同环境条件对光合机构主要是PSII的供体侧、受体侧及PSII反应中心的影响。
关键词:
快速叶绿素荧光诱导动力学;光合机构;PSII;原初光化学反应;JIP-测定中图分类号:
Q945
光合作用是植物和光合细菌将光能转化为化学能的过程。
天线色素分子吸收的光能主要用于反应中心的光化学反应,而过量的激发能则以热耗散等方式耗散掉（Krause和Weis1991。
色素分子的荧光发射除了受到激发能的传递、天线色素和反应中心色素的性质和定位的影响外,还受反应中心的氧化还原状态及光系统II（PSII反应中心供体侧和受体侧氧化还原状态的影响（Krause和Weis1991;Maxwell和Johnson2000。
Kautsky和Hirsh（1931最先认识到光合原初反应和叶绿素荧光存在着密切关系。
他们第一次报告了经过暗适应的光合材料照光后,叶绿素荧光先迅速上升到一个最大值,然后逐渐下降,最后达到一个稳定值。
此后,随着研究的深入,人们逐步认识到荧光诱导动力学曲线中蕴藏着丰富的信息。
近年来快速叶绿素荧光诱导动力学的应用,使PSII供体侧和受体侧电子传递的研究更加深入（Strasser和Govindjee1991,1992;Govindjee1995;Strasser等1995,2000,2004。
Strasser和Strasser（1995在生物膜能量流动（Strasser1981基础上建立了针对快速叶绿素荧光诱导曲线的数据分析和处理方法——JIP-测定（JIP-test,为深入研究光合作用原初反应提供了有力而便捷的工具。
本文结合作者的研究结果,简要介绍JIP-测定的原理及其应用。
1 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的定义及测定
1.1 定义
将暗适应的绿色植物或含有叶绿素的部分组织突然暴露在可见光下之后就会观察到,植物绿色组织发出一种强度不断变化的暗红色荧光,荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。
这一现象最早是由Kautsky发现的,因此也称为Kautsky效应。
植物发出的荧光强度随时间而变化,在从暗适应到暴露在光下时,荧光强度先上升,然后下降。
一般情况下,刚暴露在光下时的最低荧光定义为O点,荧光的最高峰定义为P点,快速叶绿素荧光诱导动力学曲线指的就是从O点到P点的荧光变化过程（图1,主要反映了PSII的原初光化学反应及光合机构的结构和状态等的变化（Krause和Weis1991;Strasser等1995,2000,2004,而下降的阶段主要反映了光合碳代谢的变化,随着光合碳代谢速率的上升,荧光强度逐渐下降（Krause和Weis1991。
图1 典型的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线Fig.1 AtypicalchlorophyllafluorescencetransientAplottedonalineartimescale;Bplottedonalogarithmictimescale.
56031卷
植物生理与分子生物学学报1.2 测定
叶绿素荧光诱导动力学曲线的测定可采用调制脉冲式和连续激发式（非调制式两种不同的荧光仪,它们各有不同的特点。
由于调制式荧光仪用来测量荧光的光源是调制脉冲光（高频率的闪光,植物发出的荧光信号与背景光可以区分开,所以用它可以在有背景光的情况下测定。
常用的调制式荧光仪的测量步骤是,先打开测量光（measuringlight,测暗适应叶片的最小荧光（Fo,然后打开饱和脉冲光（saturatingflashlight测暗适应叶片的最大荧光（Fm,然后再开启作用光（actiniclight使所测材料进行光合作用。
当所测材料光合作用达到稳态后测稳态荧光（Fs,然后打开饱和脉冲光测光适应后的最大荧光（Fm’,关掉作用光,打开远红光（far-redlight优先激发PSI使PSII电子传递体处于氧化状态,测定光适应叶片的最小荧光（Fo’。
根据这些参数可以计算暗适应下PSII的最大量子产额[Fv/Fm=（Fm–Fo/Fm]、光适应下PSII的最大量子产额[Fv’/Fm’=（Fm’–Fo’/Fm’]、光适应下的PSII反应中心开放的比例[qp=（Fm’–Fs/（Fm’–Fo’]、光适应下PSII的实际光化学效率[ΦPSII=（Fm’–Fs/Fm’]（Genty等1989和光适应下的非光化学猝灭（NPQ=Fm/Fm’–1（Demmig-Adams和Adams1996等。
除了Fv/Fm反映了荧光诱导动力学曲线上升过程的O-P段外,其它参数都是反映P点之后的下降过程。
由于光合作用的碳同化反应能反馈影响光合原初反应,调制式荧光仪主要通过测量光合作用的原初光化学反应的情况来探测光合作用的碳同化等反应启动后的光能捕获、转化及利用情况。
而对于碳同化反应活化前PSII的光化学变化,所获得的信息就很少了。
由于时间分辨率及信噪比的限制,对于从O-P上升过程中荧光变化的信息量的获得,与连续激发式荧光仪相比,调制式荧光仪远不及前者。
连续激发式荧光仪（PEA或HandyPEA,Hansatech,英国主要是通过短时间照光后荧光信号的瞬时变化反映暗反应活化前PSII的光化学变化,它具有相当高的分辨率（初始记录速度为每秒钟10万次,即100kHz,所以能够从O-P上升过程中捕捉到更多的荧光变化信息,如O-P变化过程中的
另外两个拐点（J点和I点。
从照光后的10µs到5min内不同时间的荧光信号都能被Handy-PEA按时记录。
在对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线作图时,为了更好地观察J点和I点,一般把代表时间的横坐标改为对数坐标,结果得到O-J-I-P诱导曲线（图1B。
与调制式荧光仪相比,连续激发式荧光仪有以下优点:
获得信息量大、操作简便快捷、测定易于多次重复、仪器便于携带、存储量大、价格低廉。
下面就O-J-I-P快速荧光诱导动力学曲线及JIP-测定做具体介绍。
2 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的意义
2.1 特征位点
典型的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线有O、J、I、P等相（Strasser和Govindjee1991,1992;Strasser等1995,2000,2004（图1B。
植物的光合机构包括光系统II（PSII和光系统I（PSI,植物被照光后,PSII的捕光色素将捕获的光量子传递给反应中心（P680,使P680受激发处于第一激发单线态（P680*,P680*很不稳定,将受激发产生的电子传递给P680受体侧的去镁叶绿素（Pheo,生成P680+Pheo-,然后Pheo-将电子传递给PSII的电子受体:
初级醌受体（QA、次级醌受体（QB及质体醌（PQ等,最后经质兰素（PC传递到PSI的反应中心（P700,生成的P680+可以从P680的供体侧夺取电子,并最终导致H2O的裂解。
与P680一样,P700受光激发后,生成P700*,P700*将受激发产生的电子传递给铁氧还蛋白,生成P700+,并最终由铁氧还蛋白-NADP+还原酶把NADP+还原为NADPH,用于光合碳的还原,P700+又可以接受从PSII传来的电子,形成可持续的电子传递。
电子传递的过程伴随着质子的传递和跨膜质子梯度的生成,并最终偶联ATP的生成。
在光合机构捕获光能发生电子传递的同时,还有一部分能量以热和荧光的形式耗散掉。
这三者之间是互相竞争的关系,任何一者的改变都会导致其它二者发生变化。
例如,如果电子传递受阻,荧光和热耗散就会上升。
植物绿色器官在经充分暗适应后,PSII的电子受体:
QA、QB及PQ等均完全失去电子而被氧化（Krause和Weis1991;Strasser等1995。
这时PSII
561
李鹏民等:
快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用6期的受体侧接受电子的能力最大,PSII反应中心可最大限度地接受光量子,即处于“完全开放”状态,此时样品受光后发射的荧光最小,处于初始相“O”（Fo。
当对样品照以强光时,PSII反应中心被激发后产生的电子经由Pheo传给QA,将其还原,生成QA-。
此时,由于QB不能及时从QA-接受电子将它氧化[P680*→Pheo-需要3ps,Pheo-→QA需要250~300ps,而QA-→QB需要100~200µs（Krause和Weis1991],造成QA-的大量积累,荧光迅速上升至J点（Govi-ndjee1995;Strasser等1995,2000,2004。
QB能够从QA-接受电子,形成QB2-,导致QA和Pheo完全进入还原状态。
此时PSII反应中心完全关闭,不再接受光量子,荧光
产量最高,出现P点。
在电子从QA-向QB传递过程中出现的I点（图1B反映了PQ库的异质性（Strasser等1995;Govindjee1995,即电子传递过程中快还原型PQ库先被完全还原（J-I,随后才是慢还原型PQ库被还原（I-P。
但是,也有学者不认同这种观点,而且目前对于I-P荧光上升的过程还存在其它一些解释,所以I点出现的原因需要进一步研究。
2.2 JIP-测定的参数
植物快速叶绿素荧光诱导曲线中包含着大量关于PSII反应中心原初光化学反应的信息,通过对曲线荧光参数（表1的分析,可以知道在环境因子影响下植物材料光合机构的变化。
从动力学曲
表1 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线（O-J-I-P分析中使用的术语和公式
Table1 FormulaeandtermsusedintheanalysisoftheO-J-I-PfluorescenceinductiondynamicscurveFormulaeandtermsIllustrations
FoMinimalrecordedfluorescenceintensityFmMaximalrecordedfluorescenceintensitytFm
TimetoreachmaximalfluorescenceintensityFmVJ≡（FJ–Fo/（Fm–FoRelativevariablefluorescenceintensityattheJ-stepMo≡4（F300µs–Fo/（Fm–FoApproximatedinitialslopeofthefluorescencetransient
Sm≡（Area/（Fm–Fo
NormalisedtotalcomplementaryareaabovetheO-J-I-Ptransie（reflectingsingle-turnoverQAreductionevents
Specificenergyfluxes[perQA-reducingPSIIreactioncenter（RC]ABS/RC=Mo·（1/VJ·（1/φPoAbsorptionfluxperRC
TRo/RC=Mo·（1/VJTrappedenergyfluxperRC（att=0ETo/RC=Mo·（1/VJ·ψo
ElectrontransportfluxperRC（att=0DIo/RC=（ABS/RC–（TRo/RCDissipatedenergyfluxperRC（att=0
Yieldsorfluxratios
φPo≡TRo/ABS=[1–（Fo/Fm]Maximumquantumyieldforprimaryphotochemistry（att=0ψo≡ETo/TRo=（1–VJ
ProbabilitythatatrappedexcitonmovesanelectronintotheelectrontransportchainbeyondQA-（att=0
φEo≡ETo/ABS=[1–（Fo/Fm]·ψo
Quantumyieldforelectrontransport（att=0Phenomenologicalenergyfluxes[perexcitedcrosssection（CS]
ABS/CSo≈Fo
AbsorptionfluxperCS（att=0TRo/CSo=φPo·（ABS/CSoTrappedenergyfluxperCS（att=0ETo/CSo=φEo·（ABS/CSoElectrontransportfluxperCS（att=0DIo/CSo=（ABS/CSo–（TRo/CSoDissipatedenergyfluxperCS（att=0
DensityofreactioncentersRC/CSo=φPo·（VJ/Mo·（ABS/CSoDensityofRCs（QA-reducingPSIIreactioncentersPerformanceindexes
PIABS≡（RC/ABS·[φPo/（1–φPo]·[ψo/（1–ψo]Performanceindexonabsorptionbasis
PICS≡（RC/CSo·[φPo/（1–φPo]·[ψo/（1–ψo]
Performanceindexoncrosssectionbasis（att=0
Whent=tFm,CSowasreplacedbyCSm,ABS/CSm≈Fm.
56231卷植物生理与分子生物学学报
线上可以得到大量的原始数据,为了能更好地反
映动力学曲线和被测样品材料的关系,Strasser和
Strasser（1995以生物膜能量流动为基础,通过计
算能量流和能量比率来衡量在给定物理状态下样品
材料内部变化,建立了高度简化的能量流动模型
图（图2。
依照能量流动模型,天线色素（Chl吸
收的能量（ABS的一部分以热能和荧光（F的形式耗
散掉,另一部分则被反应中心（RC,在JIP-测定
中RC指有活性的反应中心所捕获（TR,在反应
中心激发能被转化为还原能,将QA还原为QA-,
后者又可以被重新氧化,从而产生电子传递（electrontransport,ET,把传递的电子用于固定CO
2
或其它途径。
在此基础上发展起来的数据处理（表1称为“JIP-测定”（Strasser和Strasser1995;Krüger等1997;Strasser等2000,2004。
JIP-测定为我们提供了被测样品材料的大量信息,如光合器官在不同环境条件下的结构和功能的变化（Strivastava和Strasser1996;Jiang等2003;Hermans等2003;vanHeerden等2003,2004。
在快速叶绿素荧光诱导动力学曲线参数中,
V
J
反映了照光2ms时有活性的反应中心的关闭程
度;Mo反映了Q
A
被还原的最大速率,即O-J过
程中Q
A
被还原的速率（Strasser和Strasser1995;Strasser等2000,2004,它与反应中心色素、捕
光色素和QA所处的状态有关;S
m
反映了使QA完
全被还原所需要的能量,即PSII反应中心受体侧PQ库的大小,电子从Q
A
-进入电子传递链越多,则
到达Fm所需要的时间就越长,S
m
的值也越大。
叶
片在受到光破坏时,D1蛋白降解加剧,结果使电
子传递体,特别是Q
B
易从蛋白复合体上脱落下
来,造成受体库容量的减小,表现为S
m
减小（Strasser等1997。
φ
Po
反映了暗适应后的最大光化学效率,其意
义与调制脉冲式荧光仪测定的参数F
v
/F
m
相同;ψo反映了在反应中心捕获的激子中（激子是指由高能电子激发的量子,它能转移能量但不能转移电
荷,用来推动电子传递到电子传递链中超过QA的其它电子受体的激子占用来推动Q
A
还原激子的比率,即照光2ms时有活性的反应中心的开放程
度;φ
Eo
反映了反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额,即反应中心吸收的光能将电子传递
到电子传递链中超过Q
A
的其它电子受体的概率。
而且,通过JIP-测定还可以分析光合机构的比活性,即活跃的单位反应中心（RC或单位受光面积
（CS的各种量子效率（ABS/RC、TR
o
/RC、ETo/
RC、DI
o
/RC、ABS/CS、TR
o
/CS、ET
o
/CS、DIo/CS等,表1以及单位面积上的反应中心的数量（RC/CS。
比活性可以更确切地反映植物的光合器官对光能的吸收、转化和耗散等状况。
性能指数
（PI
ABS
、PI
CS
包含了3个参数[RC/ABS（或RC/CS、
φ
Po
和ψ
o
],这3个参数相互独立,所以性能指数和推动力可以更准确地反映植物光合机构的状态,
它们对某些胁迫比F
v
/F
m
更敏感,能更好地反映胁迫对光合机构的影响（Appenroth等2001;vanHeerden等2003,2004。
3 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线在光合作用研究中的应用
植物本身的生理变化如衰老（Lu和Zhang1998a;
Dai等2004,或者逆境胁迫如缺铁或锰饥饿（Jiang等2001,2002,2003、高温（Guissé等1995;Lu和Zhang1999;Chen等2004a、低温（Fryer等1998、盐胁迫（Lu等2003a,b;Chen等2004b及干旱（Eggenberg等1995;Lu和Zhang1998b等都能够直接或间接地影响植物PSII的功能。
当环境条件变化时,叶绿素荧光的变化可以在一定程度上反映环境因子对植物的影响（Krause和Weis1991;Maxwell和Johnson2000;Jiang等2003,通过对不同环境条件下快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的分析,
图2 高度简化的能量在光合器官中的流动模型图
Fig.2 Ahighlysimplifiedschemefortheenergycascadefromlightabsorptiontoelectrontransport
563
李鹏民等:
快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用6期可深入了解以上这些因素对植物光合机构主要是PSII的影响以及光合机构对环境的适应机制。
3.1 分析PSII供体侧的变化
当PSII的供体侧受到伤害时,经过极短的时间（在J点之前,叶绿素荧光强度就会上升,出现K点（照光后大约300µs处的特征位点,多相荧光O-J-I-P变为O-K-J-I-P（Guissé等1995;Strivastava和Strasser1996;Srivastava等1997;Chen等2004b,甚至有更多的拐点出现,变为O-L-K-J-I-H-G-P（Strasser等2004。
如高温胁迫导致K点（300µs出现,K点的出现是由于水裂解系统被抑制和QA之前受体侧的部分被抑制所造成的（Guissé等1995;Strasser等2000,2004。
在此抑制过程中,受伤害的是放氧复合体（OEC,所以K点可以作为OEC受伤害的一个特殊标记（Eggenberg等1995;Strasser等2000,2004。
小麦经过热处理（25~45℃后出现明显的K点,这说明高温伤害了OEC（Lu和Zhang1999。
Lu等（2003b的研究结果表明,盐适应增强了植物耐高温的能力,高温处理后荧光诱导曲线上表现为K点的荧光产量增加减缓。
而且当水与PSII之间的电子传递受阻时,荧光上升变慢且荧光强度变小（Critchley等1982。
我们的结果表明,高温胁迫及缺铁都能够导致K点的出现（Jiang等2003;Chen等2004b。
此外,某些重金属的盐,如铬酸盐也能诱导K点的出现（Susplugas等2000;Appenroth等2001。
而且,通过JIP-测定数据处理方法,通过比较K点荧光强度的大小,可以计算出放氧复合体被破坏的程度（Lu和Zhang1999;Appenroth等2001;Chen等2004a。
3.2 分析PSII受体侧的
升级会员 