第二章绪论2.docx

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第二章绪论2

第二章生物工业菌种与种子的扩大培养

二、微生物工业对菌种的要求

1．原料廉价，生长迅速，目的产物产量高

2．易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短

3．抗杂菌和噬菌体的能力强

4．菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。

第二节工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏

一、微生物菌种的衰退

1．菌种衰退的原因

原因主要有三个方面：

一是菌种保藏不妥，二是菌种生长的条件要求没有得到满足，或遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件；三是诱变得来的新菌株发生回复突变。

1）菌种连续传代是菌种发生退化的直接原因。

突变概率为10-8—10-9

2）采用保藏效果较差的方法和条件，以及保藏操作不当，菌种就较易发生退化。

3）菌种的回复突变也会使已获得的优良性状退化和消失

回复突变——变异菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得优良性状的退化。

回复突变的原因：

a）发生不完全突变：

DNA双链中仅有一条链发生点突变。

b）产生异核菌丝：

对具有两个核以上细胞的菌株，如果只有一个或几个核发生变异，会形成性状不同的菌丝。

c）菌落不纯：

菌落中只有一个高产突变的孢子或细胞，菌落不是由一个孢子或细胞组成。

2．菌种性能的改变

1）菌种遗传特性的改变的原因：

a）异核现象导致微生物群体发生变异：

邻近菌丝细胞间发生吻合，或个别核发生变异而产生。

b）自发突变导致菌种遗传特性改变：

DNA发生改变。

c）回复突变或产生分离子：

使菌种群体中形成具有不同基因型的个体。

2）菌种生理状况的改变

a）菌种是一个不纯的群体，其中变异株所占的比例决定该菌种的特性。

b）菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。

C）在某些情况下，菌种的基团处于活化状态或阻遏状态，而时菌种生理状态发生改变。

3．防止菌种衰退的措施

1）尽量减少传代次数。

2）菌种的分离：

分离出其中未衰退的菌体

3）菌种的复壮：

这是指一种广义的复壮，在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离测定，使之生产性能逐步提高。

4）提供良好的环境条件：

进行合理传代，只用三代内的菌种，采用培养条件有利于高产菌，不利于低产菌。

5）用优良的保藏方法：

尽可能采用斜面冰箱保藏，真空冷冻干燥，干孢子保藏等。

6）定期纯化菌种，对菌种进行定期的分离纯化，可减少其中共存的自发突变或突变不完全株，保持原来的优良特性。

二、菌种的复壮

这指的是一种狭义的复壮，当菌种已经发生衰退后怎样进行复壮。

1）纯种分离：

通过纯种分离，把退化菌种中的一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，分为两种方法：

菌落纯——平板划线法等

细胞纯——显微镜操作法等

2）通过寄主体进行复壮：

对于寄主性微生物的退化株，可通过接种到相应的昆虫或动物寄主体内以提高其毒性。

3）淘汰已衰退的个体；采用改变培养条件，如低温，高温或改变营养成份等，使得衰退个体大量死亡，保留未退化的个体。

三、菌种保藏

1．菌种保藏的原理

人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。

·利用菌种休眠体：

孢子，芽孢等。

·利用休眠状态环境条件：

低温，干燥，隔绝空气或氧气，缺乏营养物质等。

2．菌种保藏方法

1）斜面低温保藏法：

保存期约1~3个月，4℃，避免水分蒸发、收缩、板结、“盐害”

2）液体石蜡封存保藏法

在斜面上加入灭菌后的液体石蜡，高出斜面1cm，使菌种与空气隔绝，4℃保存，保存期约1年。

3）固体曲保藏法

根据传统制曲原理改进而成，适用于产孢子的真菌，可用麦皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产唾大量休眠体（孢子）后加以保存。

该法的要点是控制适当水分，低温或室温保存，保存期约1~3年。

4）砂土管保藏法

用人工法模拟自然环境使菌种得以栖息，适用于产孢子放线菌，霉菌和产芽孢的细菌。

5）冷冻干燥法

原理是在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。

细胞不易发生死亡和变异，适用于各种微生物，保存期为5~10年。

6）液氮超低温保藏法

微生物在-130℃以下，新陈代谢停止，可永久性保存微生物菌种。

液氮的温度可达-196℃，这是一种理想的微生物保存方法。

需要有液氮罐，冰箱设备。

将菌液置于10%甘油或二甲基亚砜保护剂中，密封于安瓿瓶内，放置0℃，-20℃，再放入液氮罐中保存，几乎可以永远保存。

3．菌种保藏的注意事项

1）菌种保藏前所处的状态

选用休眠体，采用新鲜斜面上的生长丰满的培养物，应注意培养温度，时间等。

2）菌种保藏所用基质

应碳源比例少，营养成分贫乏些。

3）操作过程对细胞结构的损害

冻结速度应迅速，应加适量保护剂，避免形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。

第三节工业微生物菌种的选育

菌种选择的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。

菌种选育：

自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合技术、DNA重组技术

1、自然选育——不经过人工诱变处理，包括从自然界分离获得的菌株根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。

1．从自然界分离获得菌株

自然界分离新菌种包括四个步骤：

采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。

1）采样

a.根据筛选目的，确定采样地点。

b.取离地面5~15cm处的土壤几十克，放入消毒好的袋中记录采样时间、地点、环境情况等，酶母菌和霉菌在腐殖质含量高的土壤中取。

2）增殖培养

如样品中含目标菌较少，应进行增殖（富集）培养，即给混合菌群提供有利于目标菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，促使目标菌大量繁殖，便于分离它们。

a.控制碳源，生长因子、盐等b.控制PHc.添加抑制剂d.控制温度

3）纯种分离

增殖培养后还含有杂菌，需进行纯种分离，才能获得纯种，一般是采用单菌落分离法。

a.平板划线法b.菌液稀释法

为避免孢子之间的粘连和吻合，可进行液体培养，玻璃珠，石英砂振荡，或加入0.05%的分散剂

4）生产性能的测定

a.初筛：

进行一些定性或半定量测定

b.复筛：

初步进行工艺条件摸索

c.终试验：

选出较优菌株1~3株，进行进一步生产性能试验和毒性试验等。

2．从自发突变体中获得菌株

微生物的自发突变虽然频率较低，但也时有发生，有时也会出现一些优良变异菌株，我们通过筛选可将其选出，可以自发突变的频率较低，往往满足不了生产的需求，必须要进行人工诱变。

自然育种的作用：

在工业生产中可以达到纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产量的目的。

缺点：

效率低，进展慢，很难使生产水平大幅增加

二、诱变育种

诱变育种的优点：

·突变频率高·变异谱宽·速度快·方法简便

诱变育种主要有两个环节：

诱变剂的处理和采用合适的方法淘汰负效应变异株。

选育的程序有五个步骤：

①出发菌株的选择；②菌悬液的制备；③前培养；④诱变；⑤变异菌株的分离和筛选。

1．出发菌株的选择

出发菌株——工业上用来进行诱变处理的菌株。

出发株有三类：

①从自然界分离得到的野生型菌株；②通过生产选育，即自发突变经筛选得到的高产株；③已经诱变过的菌株；④先行杂交，再作诱变的出发株。

2．菌悬液的制备

1）处理前细胞尽可能达到同步生长状态（选择法或诱导法）

2）一般采用对数期细菌的营养细胞，或霉菌，放线菌刚刚成熟的孢子

3）菌悬液浓度为：

真菌孢子或酵母菌为106个/ml，细菌和放线菌孢子为108个/ml

4）细胞悬液经玻璃珠振荡打散

5）用脱脂棉或滤纸过滤，以达到单细胞状态

3．前培养

透变处理前，将细胞在添加嘌呤，嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养20~60min，再进行诱变处理，则可提高诱变率。

4．诱变

凡可提高基因诱变率的物质都称诱变剂，分为物理诱变剂和化学诱变剂两种。

5．变异菌株的分离和筛选

诱变处理后，大多属于负突变体：

需要有有效的筛选方案和方法才能在短时间内选出优良性能的变异株。

筛选一般分为两个阶段：

初筛，以量为主，复筛，以质为主。

三、诱变育种方案设计

（一）突变的诱发

1．诱变剂接触DNA分子

①诱变剂要进入细胞②基因所处的状态，转录期为佳

③与培养条件有关

2．DNA损伤的修复（以紫外照射为例）

微生物有五种修复DNA损伤的方式

1）光复活作用：

可见光可激活光复合酶，与二聚体结合，从而切除二聚体

2）切补修复;在四种酶的协同作用下可进行DNA损伤修复；内切酶、外切酶、DNA多聚酶和DNA连接酶。

3）重组修复:

重组修复必须在DNA复制时进行，复制时在二聚体处留下一个空隙，通过染色剂交换，可将二聚体换掉，然后再补上空缺。

4）SOS修复系统:

是一种能造成误差修复的“呼救信号”修复系统。

在修复过程中，DNA多聚酶在无模板的情况下进行DNA修复合成，因此容易造成错差，导致基因突变。

5）DNA多聚酶的校正作用:

DAN多聚酶（I、II、III），除了多功能聚合作用外，还具有3’到5’核酸外切酶作用，可切除不正常核苷酸，达到校正目的，但DNA多聚酶发生突变，外切酶活性减弱，菌体的突变率会相应提高。

该株称增变突变型，对诱变剂格外敏感。

3．从前突变到突变

诱变前后的处理可影响诱变的效果，有两方面：

1）通过影响与DNA修复作用有关的酶活性

2）通过使诱变的基因处于活化状态，如复制或转录状态

4．从突变到突变型

突变基因的出现不等于突变表型的出现，表型改变落后于基因型改变称为表型迟延，分为分离性迟延和生理性迟延。

1）分离性迟延

诱变后基因处于不纯的状态，突变型居于隐性基因，需经几代的复制、分离，在细胞中成为纯的状态才能表达。

2）生理性迟延

突变基因成为纯合状态后，还不一定出现突变表型，必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。

一般要经过几个世代。

（二）诱变剂的种类及选择

1．诱变剂

（三）出发菌株的选择

1．选择纯种作为出发菌株：

以排除异核体或异质体的影响。

2．选择出发株，不仅产量高，而且产孢子早而多，色素少，生长速度快等有利于合成发酵产物的性状。

3．选择对诱变剂敏感的菌株出发株；可提高变异频率，而且高产突变株出现率也高。

2．营养缺陷型的筛选方法

1）再经中间培养——减少以后出现分离子

2）淘汰野生型——抗生素法，菌丝过滤法，差别杀菌法，饥饿法

3）检出营养缺陷型——逐个测定法，夹层平板法，限量营养法，影印接种法

4）确定生长谱——确定出缺陷什么样，是氨基酸、维生素，还是嘌呤，嘧啶缺陷型

①初级代谢产物的筛选

利用合成途径中的反馈阻遏或反馈抑制原理，筛选生产氨基酸、核苷酸、维生素等菌株。

a.降低终产物浓度，筛选终产物营养缺陷型

b.筛选抗反馈突变株，获得结构类似物（代谢物）的抗性突变株

·利用与代谢产物类似的化合物处理微生物细胞，杀死或抑制绝大多数细胞，选出能产生该代谢物的抗反馈突变株。

·利用回复突变筛选抗反馈株，获得非完全的回复突变株，第二次的诱变使得产物合成酶的调节位点改变，而不能与产物结合，因而不受产物的反馈抑制。

②次级代谢产物的筛选

利用次级代谢途径与初级代谢途径之间的关系筛选次级代谢产物的突变株，主要是一些抗生素高产株。

a.利用营养缺陷型筛选

当某些次级代谢和初级代谢处于同一分枝合成途径时，筛选初级代谢产物的营养缺陷型可使相应的次级代谢产物增产。

b.筛选负变株的回复突变株

由于两次突变都在抗生素合成有关基因上，动摇了其遗传基础，该途径受酶调节的程度往往很低，容易人工控制，并且产量从无到有，或很高，比较容易检出。

c.筛选出磷酸盐调节的突变

磷酸盐对抗生素生物合成有抑制作用，去磷酸盐调节突变株可消除这种抑制作用以获得高产

d.筛选去碳源分解代谢调节突变株

菌株在快速分解利用碳源时对其他许多代谢途径中的酶，包括许多抗生素合成酶，有阻遏或抑制作用。

筛选去碳源分解代谢调节突变株，有利于提高抗生素发酵产量。

可采用“葡萄糖效应”来进行筛选。

——将菌株在含有葡萄糖和组氨酸为唯一氮源的培养基中连续传代，可选出去葡萄糖分解代谢调节突变株。

——能在这种培养基中生长的只有两种菌株：

一组氨酸分解酶发生了突变，不再受阻遏，二是葡萄糖分解代谢有关酶发生突变，不再产生那么多分解代谢阻遏物。

后一种是我们需要的。

——也可利用葡萄糖的毒性结构物质来筛选突变株，在培养基中加入半乳糖和毒性物质，菌株不能利用毒性物质，但可抑制菌利用半乳糖。

只有去葡萄糖分解代谢调节突变株能够利用半乳糖进行生长。

e.筛选氨基酸结构类似物抗性突变株

许多抗生素和氨基酸有共同的前体，或有些氨基酸本身可以作为某些抗生素的前体，氨基酸代谢与抗生素的合成有密切联系，打破氨基酸代谢调节，可导致抗生素的高产。

在培养基中加入氨基酸结构类似物，对菌的生长有抑制作用，可以筛选到解除氨基酸反馈调节的突变株。

从而提高抗生素前体的量，进一步提高抗生素产量。

f.筛选二价金属离子抗性突变株

加入能和产物（抗生素）或其中间体结合的二价金属离子（生长抑制剂），当达到一定浓度时，抗生素低产株不生长，而高产株能幸存，因为形成大量产物或中间体能与二价离子结合，以解除其毒性。

因此，可筛选出高产株。

g.筛选前体或前体结构类似物抗性突变株

前体或前体结构类似物对某些抗生素生产菌的生长有抑制作用，且可抑制抗生素的合成，筛选对前体或前体结构类似物的抗性突变株，可以消除其对菌的生长及其抗生素合成的抑制作用，提高产量。

h.筛选自身所产的抗生素抗性突变株

生产菌株对其自身所产的抗生素耐受能力不同，高产株的耐受力大于低产菌株。

因此，可用自产的抗生素来筛选高产菌株。

（五）突变基因的表现

突变基因的遗传特性改变了，其培养条件也应作出相应的改变，高产菌株筛选出来后，要进行最佳发酵条件的研究，使高产基因能在生产规模下得以最好的表达。

第四节生产菌种的改良

原生质体融合一般步骤：

标记菌株的筛选，原生质体的制备，原生质体的融合，融合子的选择，实用性菌株的筛选等。

原生质体融合育种主要步骤如下：

选择两个有特殊价值并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本，在高渗透压溶液中，用适当脱壁酶去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。

这时原生质体对溶液和培养基的渗透压非常敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持生存，在低渗透压溶液中将会破裂而死亡。

两种不同的原生质体在高渗透压条件下混合，在聚乙二醇和Ca2+作用下，发生细胞膜融合，PEG是一种脱水机，由于脱水作用，原生质体开始聚集收缩，相邻的原生质体融合的大部分面积紧密接触。

开始原生质体融合仅在接触部位的一小块区域，形成细小的原生质体，继而逐渐变大导致两个原生质体融合。

Ca2+可提高融合效率。

在融合时两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组，再生的细胞菌落中就有可能获得具有理想状态的重组菌株。

1．标记菌株的筛选

供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择：

标记一般为营养缺陷型和抗药性。

梯度平板法

2．原生质体的制备

①菌体的预处理②菌体的培养时间③酶浓度④酶解温度与时间⑤渗透压稳定剂。

影响原生质体制备的因素主要有以下几个方面：

3．原生质体的融合与再生

·聚乙二醇（PEG），可使原生质体的膜电位下降，促进Ca++交换，也通过渗透压的脱水作用使细胞凝集（扰乱膜表面的蛋白和脂质的排列，提高流动性）。

·Ca++，原生质体可通过Ca++交换而促进凝集，从而提高融合率。

4．融合子的选择

依靠两个亲本的选择遗传标记，在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。

一般产生两种情况：

真正的融合：

产生杂合二倍体或单倍重组体

假融合：

形成异核体

两者均可以在选择培养基上生长，异核体不稳定，传代后会分离。

因此，融合后必须再生后进行几代自然分离，选择，才能确定出真正融合子。

5．灭活原生质体融合技术在育种中的应用

采用热，紫外线，电离辐射以及某些生化试剂，抗生素等处理原生质体，使之失去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补，可以形成再生的融合体。

1）单一亲株灭活2）双亲株或多亲株灭活

该方法的优点是可以不需要遗传标记

三、DNA重组技术

（一）DNA重组过程

1．基因分离

将DNA分子从细胞中分离提取出来，基本步骤如下：

SDS溶解细胞

↓

酚，蛋白酶去除蛋白质

↓

核糖核酸酶去除RNA

↓

乙醇沉淀DNA

2．DNA分子的切割与连接

限制性内切酶→识别和切割DNA分子

连接酶→连接有粘性末端或平末端的DNA分子

3．载体

载体可将外源DNA片段引入宿主细胞，主要有四大类：

质粒，黏粒、入噬菌体，M13噬菌体

4．引入宿主细胞

5．重组体的选择和鉴定

6．外源基因的表达

外源基因能否表达，取决于三个方面：

a.转录水平——启动子及RNA聚合酶的统一

b.翻译水平——mRNA核糖体结合位与受体核糖体的统一

c.转录和翻译后的修饰——甲基化、糖基化等

（二）分子育种技术

分子育种是应用基因工程手段（DNA重组）来进行的。

1．链霉菌的基因克隆

1）制备供体DNA及酶切

2）制备载体DNA——链霉菌质粒或噬菌体分离及酶切

3）连接载体和供体DNA片段

4）将受体菌制成原生质体

受体菌的选择应注意以下几点：

a.必须缺乏一种酶活力，可由克隆的外源基因产物来补充

b.受体菌的限制性内切酶能限制来自供体的DNA，应设法降低该酶活性，如进行诱变、热处理等。

c.受体菌在制备原生质体时，先用0.5%的甘氨酸处理，使之对溶菌酶更敏感。

5）转化作用：

用PEG将DNA导入原生质体

6）再生和选择：

转化后先将原生质体涂于不含有药物的再生培养基上，进行一段时间非选择性再生，然后将药物加到再生培养基上，杀灭未被转化的原生质体。

2．链霉菌抗生素合成基因的克隆

抗生素合成基因往往与相关基因，甚至抗性基因排列成簇，在克隆抗生素合成基因方面总结了以下七个策略：

1）检测克隆到标准宿主中的个别基因产物；

2）利用产生菌阻断突变株的互补作用：

以抗生素生物合成阻断突变株恢复产抗生素作为指标。

3）利用突变克隆技术：

外源基因进入抗生素的生产菌中，由于同源性就发生重组，造成该基因的表达中断或改变，以此来确定克隆基因的性质。

4）连锁的抗生素抗性基因的克隆：

抗性基因常与其合成基因连锁在一起，可先克隆抗性基因，再分析是否也含有合成基因，然后再进行合成基因的克隆。

5）用人工合成的寡核苷酸探测基因文库。

6）直接克隆抗生素产生菌DNA大片段到非产生菌中，用鸟枪法克隆一个抗生素产生菌的DNA大片段到一个非产生菌中，然后直接筛选产抗生素的克隆。

7）用一种抗生素的克隆DNA去探测相关抗生素的同源基因：

很多重要抗生素如四环线、红霉素、阿霉素、利福霉素等都是聚酮体抗生素、多功能合成酶（聚酮体合成酶）的氨基酸序列具有保守性，编码聚酮体合成酶的DNA就可作为探针用于分离其他基因。

3．利用基因工程技术生产新的抗生素

将一种抗生素生物合成基因引入产生结构相似的抗生素产生菌，可改变抗生素的结构。

一般有两种情况：

1）引入的羟化酶基因使原有的抗生素发生羟化；

2）可合成兼有二者结构的新抗生素结构。

4．利用基因工程技术生产氨基酸

氨基酸的基因克隆多采用鸟枪法：

供体菌DNA提取

↓

一种或几种内切酶处理

↓

切成一个或大于一个基因片段大小

↓

都与载体连接

↓

转化到另一菌株进行无性繁殖

↓

筛选含有目的基因的转化子

第五节种子的扩大培养

一、种子制备的过程

固体培养基上生产大量孢子—孢子制备，在液体培养基中生产大量菌丝—种子制备。

1．孢子制备

1）放线菌孢子的制备

a.孢子采用琼脂斜面培养基

b.营养成份：

麦皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等；

c.碳源和氮源不要太丰富，不利于孢子形成（碳1%，氮0.5%）

d.干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成

e.温度为28℃-37℃，时间为5~14天

f.两种种子入罐法：

一是孢子入罐法（常用），另一是摇瓶菌丝入罐法（缩短种子在罐内培养时间）

放线菌发酵生产的工艺过程如下：

菌种—母斜面（孢子）—子斜面（孢子）—摇瓶种子（菌丝）—种子罐—发酵罐

2）霉菌孢子的制备

a.以天然农产品为培养基：

大米、小米、玉米、麦皮、麦粒等

b.培养温度为25~28℃，时间为4~14天

3）细菌培养物的制备

a.采用碳源限量而氮源丰富的配方，如牛肉膏、蛋白胨

b.温度为28℃~37℃，时间为1~2天，产芽孢菌5~10天

2．种子制备

将固体培养的孢子转入液体培养，繁殖大量菌丝或菌体的过程。

培养条件应有利于孢子发芽和菌丝繁殖。

阶段：

①实验室种子的制备②生产车间种子的制备

1）摇瓶种子制备

孢子发芽和菌丝繁殖缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子制度，培养配方和条件与种子罐相似。

常采用母瓶、子瓶两级培养，两种都可直接进罐。

母瓶——营养丰富和完全，氮源丰富有利菌丝生长，但各种成价不宜过浓。

子瓶——培养基浓度以母瓶略高，更接近种子罐配方。

2）种子罐种子制备

因菌种不同而异，一般为分一级种子，二级种子和三级种子的制备。

孢子（或摇瓶菌丝）→小体积种子罐→一级种子→发酵罐→二级种子→大发酵罐→三级种子

种子罐的级数主要决定于菌种的性质和生长速度及发酵设备的合理应用。

目的是要形成一定数量和质量的菌体。

种子制备的目的：

形成一定数量和质量的菌体

种子罐级数的减少，有利于生产过程的简化及发酵过程的控制，可以减少因种子生长异常而造成发酵的波动。

三、种子培养

工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型，通气培养实用于好氧和兼性好氧菌的培养。

静置培养法是将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。

而通气培养法的生产菌种以好氧菌和兼性好氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体快速生长和发酵，又称为好氧性培养。

1．表面培养法

是一种好氧静置培养法，分固态和液态两种，其生长速度与培养基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快。

2．固体培养法

分为浅层和深层固体培养两种，也称曲法培养，特点是固体曲的酶活力高。

3．液体深层培养

从罐底部通气，搅拌培养法。

其特点是容易根据培养要求和时间控制通气，搅拌，温度与氢离子浓度等条件。

1）深层培养的三个控制点a.灭菌b.温度控制c.通气，搅拌

2）几种深层培养法

a.控制培养法b.载体培养法c.两步法

第一步：

菌体在丰富培养基上大量繁殖，收集，浓度，洗涤，再转入产酶培养基。

第二步：

产酶培养基中加入诱导产酶诱导剂，菌体一般不繁殖，只是积累大量的酶。

四、种子质量的控制

（一）影响孢子质量的因素及其控制

孢子质量与培养基，培养温度、湿度、时间、接种量等都有关。

2）控制

原材料：

材料中的糖、氮、磷含量需经化学分析及摇瓶发酵试验合格后使用。

水质：

尽量使用蒸馏水或无盐水中加入适量无机盐，供配制培养基，比较容易控制。

氮源：

供生产用或制备孢子和传代，应使用较单一的氮源，以保证正常菌落类型的优势。

作为选种或分离平板，则需用较复杂的有机氮源便于选择特殊代谢的菌落。

①成分应适应种子培养基的需要（利于直接吸收利用）

②营养成分要尽可能和发酵培养基相近

2．培养温度和湿度

2）控制

温度：

对不同的菌应测试其最适生长温度，一般温度控制低一些，有利于孢子的形成。

湿度：

北方湿度控制在40%~45%，而南方控制在35%~42%。

一般来说，真菌对湿度要求偏高，放线菌要求偏低。

3．培养时间和冷藏时间

1）培养时间

培养时间对孢子质量有重要影响，时间太短，孢子过于年青，经不起冷藏，会发生自溶，时间太长，孢子过