蛋白质高分辨结构测定与高效制备技术CB918600G.docx

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蛋白质高分辨结构测定与高效制备技术CB918600G

项目名称：

蛋白质高分辨结构测定与高效制备技术

首席科学家：

刘买利中国科学院武汉物理与数学研究所

起止年限：

2009.1至2013.8

依托部门：

中国科学院

一、研究内容

目前蛋白质结构研究存在的主要问题是难以高效制备适合结构测定的蛋白质样品、蛋白质晶体结构测定中对样品质量要求过高和自动化程度低、核磁共振技术测定蛋白质结构周期长且受到分子量上限的制约。

针对这些问题，本项目拟整合国内核磁共振波谱学、基于同步辐射的X-射线晶体学和蛋白质制备等领域的优势力量，发展具有自主知识产权的高分辨率、高灵敏度和快速蛋白质三维结构测定的新技术和新方法，及与之相匹配的蛋白质高效制备技术，并通过与关键生物学问题密切相关的蛋白质及蛋白质复合体结构和功能研究来检验和优化本项目所发展的各种新技术和新方法。

拟解决的关键科学问题：

1、针对目前难以高效制备适合结构测定的蛋白质样品这一瓶颈问题，综合运用可溶性表达、包涵体变复性和无细胞翻译等多种技术，并借助NMR动态监测与折叠优化技术，获得正确折叠的活性蛋白质用于结构测定。

2、针对蛋白质晶体结构测定中对样品质量要求过高和自动化程度低等问题，发展长波长反常散射技术和相位解析新技术以降低对晶体质量的要求；通过数据采集和处理的同步化提高结构测定的自动化程度；综合运用基于同步辐射的小角散射、X-射线晶体学和NMR等技术，测定蛋白质及复合体结构。

3、为突破NMR测定蛋白结构的分子量上限，并提高其测定速率，本项目拟发展同位素标记技术和快速NMR技术，发展动态NMR技术检测弱相互作用，发展固体魔角旋转NMR技术用于膜蛋白结构测定。

针对以上问题，本课题主要研究内容如下：

（一）提高蛋白质样品制备的效率

1、发展基于HSQC的快速鉴定蛋白质折叠和聚集的方法，用于蛋白质及复合体制备过程的监控，使之适合结构测定。

2、开发一系列便于操作的双融合表达载体，发展高效的蛋白质可溶性制备与纯化新技术，实现目标蛋白快速表达与纯化。

3、在已有包涵体双变性复性专利技术的基础上，筛选新的包涵体变性和复性工艺，提高专利技术的通用性，以解决包涵体变复性这一瓶颈问题。

4、利用绿色荧光蛋白（GFP）以及FSEC技术，实现膜蛋白可溶性表达和检测。

并建立麦胚和盘基网柄菌等无细胞膜蛋白表达体系。

5、通过多顺反子共表达策略构建载体，实现蛋白复合体共表达。

（二）发展蛋白质结构测定新技术，降低对样品的需求，提高结构解析的效率

1、对于结晶样品，发展基于同步辐射的蛋白质和复合体三维结构测定新技术

（1）发展自动操作技术，实现实验条件优化和数据采集、传输、处理的同步化，提高结构测定的自动化程度。

（2）利用小角散射得到的溶液状态下复合体外形，结合各组分结构，并借助分子动力学优化和NMR技术测定相互作用界面，获得复合体结构。

（3）以小角散射得到的蛋白质低分辨形状为初始模型，结合密度修正等方法解决X-射线晶体学中的相位问题。

（4）利用本项目发展的自动化技术，快速确定长波长反常散射实验的最佳波长和数据采集策略，实现对全新结构的解析。

2、对于可溶性蛋白质样品，发展核磁共振测定的新技术和方法，解析蛋白质和复合体结构

（1）发展基于偶极相互作用和极化转移机制的高灵敏度蛋白质NMR方法；利用选择性13C、15N和2H标记技术，提高NMR结构测定的蛋白质分子量上限。

（2）发展新的脉冲序列和相位循环方法，减少PR-NMR谱中的误差和伪峰；完善和优化PR-NMR重建算法，消除强对角峰引起的噪音信号，提高重建图谱质量。

（3）发展基于CPMG、极化转移和化学交换等NMR实验方法，并结合变场强实验，用于蛋白相互作用的研究和中间过程的捕获。

（4）发展测定膜蛋白主链扭转角（Ψ、Φ）和原子核间距的新方法；借助液体NMR脉冲模块，建立适合研究不同运动特征的膜蛋白链段的极化转移方法，用于膜蛋白结构测定。

（三）将以上技术应用于一些重要生物学问题

1、与疾病相关的蛋白质及其复合体结构研究：

与HIV病毒感染相关的Vta1及复合体Vta1NTD/Vps60，前列腺癌相关蛋白复合体LSD1/JMJD2C/AR，与红斑狼疮有关的OSCP蛋白及复合体。

2、与膜相关的重要蛋白质及复合体结构研究：

革兰氏阴性菌外膜蛋白运输核心-Yaet复合体，对细胞极性的产生及维持起关键作用的PAR-3/PAR-6/aPKC大型复合体。

3、与核酸相互作用的重要蛋白质及其复合体：

对神经元基因表达起负调控作用的NRSF/REST蛋白复合体等。

二、预期目标

（一）总体目标

发展具有自主知识产权的X-射线晶体学、核磁共振波谱学结构测定新技术、新方法及与之配套的蛋白质高效制备技术体系，使我国在相关领域的研究达到国际先进水平，为我国科学家在蛋白质科学前沿领域的研究提供重要的理论基础和技术支撑。

（二）五年预期目标

1、建立适合于结构测定的蛋白质高效制备技术体系，包括：

研制5个以上含不同标签的双融合表达载体，实现目标蛋白的高效表达与纯化；开发3种以上包涵体变复性体系，实现70％以上包涵体蛋白的体外复性；发展3种以上膜蛋白高效表达和纯化新技术。

运用上述技术体系实现80～100个新蛋白及复合体的制备，其中10～15个完成结构测定。

2、发展6种以上NMR结构测定新方法，包括：

3种基于偶极相互作用和极化转移机制、同位素标记等提高灵敏度和分辨率的方法；基于投影重建的快速多维NMR新方法；建立弱相互作用和动力学研究方法；建立膜蛋白结构测定的NMR方法。

3、提高X-射线晶体学结构测定的自动化程度，建立高效数据收集及结构解析平台。

发展3种以上基于同步辐射的X-射线晶体学结构测定新方法，包括：

结合小角散射技术的晶体衍射相位解析方法；建立集成X-射线晶体学、小角散射和NMR等技术解析蛋白质复合体结构的方法；发展硫元素和卤族元素反常散射方法。

上述新技术将能应用于上海光源的生物大分子晶体学实验站。

4、运用本项目建立的方法和现有技术，完成10～15个具有重要生物学意义的蛋白质或蛋白复合体的结构与功能研究。

5、形成一个方法与应用密切协作的蛋白质结构研究群体，培养博士研究生31人，博士后5人。

研究成果主要以具有自主知识产权的技术成果和研究论文形式公布，申报8～10项专利，发表SCI论文80篇，其中15～20篇论文发表在本领域有影响的刊物上。

三、研究方案

（一）总体研究思路、项目研究的技术路线及可行性

本项目针对蛋白质结构测定中的关键技术问题，发展基于同步辐射的X-射线晶体学（课题二）、核磁共振波谱学（课题三）结构测定的新技术、新方法，建立与之配套的蛋白质高效制备技术体系（课题一），并用于具有代表性和重要生物学意义的蛋白和复合体结构研究，验证和优化所发展的技术和方法（课题四）。

同时应用NMR快速筛选技术对样品制备过程中蛋白质的折叠优化进行监控，使用同位素标记技术对蛋白样品进行标记，使之适用于NMR结构测定技术。

本项目的技术路线如图2所示。

图2项目技术路线示意图

蛋白质结构测定领域中有诸多关键技术迄今仍未得到有效解决，迫切需要在快速、高分辨、自动化结构解析方法和相应的蛋白质样品高效制备技术方面取得突破。

为解决这些问题，本项目整合了国内蛋白质结构测定和蛋白质高效制备领域的优势力量，组成了一支主要由中青年学术骨干组成的创新团队，其中大部分成员有参加国家重点科学研究计划及国际科技合作的经验，在X-射线晶体学、核磁共振波谱学、蛋白质高效制备等相关研究方面，具有很好的研究基础、软硬件设施和经验积累。

在基于同步辐射的X-射线晶体学研究方面，本研究团队成员成功地完成了北京同步辐射装置上3W1A和1W2B两个生物大分子晶体学实验站的建设，并且开展了一系列的蛋白质结构测定新方法的研究，在X-射线晶体学实验及自动化等方面具有很强的研究能力。

此外，本团队成员还成功完成了北京同步辐射装置的小角散射实验站1W2A的建设，开展了小角散射研究溶液状态下蛋白质外形及小角散射和X-射线晶体学相结合等工作，已经取得很好的研究成果。

可通过集成小角散射和X-射线晶体学方法降低结构解析对晶体质量的要求，大幅度提高了同步辐射解析结构的效率，并缓解样品制备的压力。

在核磁共振波谱学研究领域，项目研究团队成员长期从事复杂生物体系的NMR研究，在蛋白质结构测定和分子间相互作用方面有着丰富的经验。

所建立的水峰抑制方法已被最大的NMR仪器公司（Bruker，Varian）作为标准方法用于生物分子结构和相互作用研究；建立了快速准确测定生物大分子支链动力学的新方法；建立了消除干扰、简化图谱、准确测定动力学参数的DMSE方法；建立了研究小分子与蛋白质弱相互作用和竞争结合的NMR分析模型；成功实现了多种快速的多维NMR方法。

上述蛋白结构测定技术的前期成果和经验积累是本项目研究在高分辨结构测定新方法取得突破的有力保障。

此外，在蛋白质高效制备技术上，项目组成员已经采用自主开发的融合表达系统，实现了10多种蛋白的首次可溶性表达；项目组成员还发展了一种新的具有自主知识产权的包涵体双变性复性技术体系，该技术特别适合于蛋白质的批量化制备，已在100多种蛋白的制备过程中获得60%以上的成功率；同时项目组还在无细胞翻译体系方面积累了成功的经验。

这三种蛋白质制备技术互补性极强，它们的组合应用将有望实现80%以上蛋白质的高效制备，从而基本解决用于结构解析的蛋白质高效制备这一瓶颈问题。

综上所述，本项目不仅拥有一支年富力强、经验丰富、勇于创新的中青年研究团队，还拥有良好的软硬件条件、强大的技术储备和卓越的创新能力，前期取得的多项拥有自主知识产权的重要研究成果将孕育着重大突破。

我们相信，本项目的实施，将在蛋白质高分辨结构测定和高效制备领域产生一批具有原创性的重大研究成果，实现关键技术的跨越式发展，从而为提升我国在蛋白质科学研究领域的国际竞争力作出重要贡献。

（二）特色和创新点

本项目最显著的特色：

集成物理学、生物学、化学、数学、信息科学和计算机科学等多学科的技术和方法；融合并发展多种蛋白质结构测定手段及与之匹配的高效样品制备方法，首次将结构测定方法和样品制备方法紧密衔接为一个整体，保证了蛋白结构测定效率的提高。

其次，本项目不仅旨在发展各种新的结构测定技术，还将对各种技术进行整合，并有意识地将所发展的技术用于各种与重要生命活动和重大疾病相关的代表性蛋白质体系的研究中，以验证和优化这些技术，保证新技术与新方法的重要应用前景。

主要的创新点：

1、利用NMR技术快速鉴定蛋白质折叠和聚集,优化适合结构测定的样品制备条件，将大大提高样品制备的效率。

2、首次在国内系统性地构建一组由His与能高效促进外源蛋白可溶性的TrxA、NusA、SUMO、Mistic蛋白所组成的双融合表达载体，嵌入柔韧性好的连接区域和特异性强的TEV识别位点，实现多种不同的蛋白质可溶性表达。

3、首次建立具有自主知识产权的通用型包涵体变复性技术体系，以此为平台高效制备重要功能蛋白质，将促进我国蛋白质科学研究的快速发展。

4、结合小角散射和X-射线晶体学方法解决蛋白质晶体学中的相位问题，不需要进行同晶置换和反常散射，大大降低了结构测定中制备单晶样品的难度，将是晶体学结构解析技术的重大发展。

5、利用自动化和智能化的方法针对不同样品选择最佳的长波长反常散射实验方案，将有利于提高我国目前尚不发达的同步辐射装置的使用效率。

6、发展各种高分辨快速NMR方法，将加速我国核磁共振波谱学在蛋白质研究中的广泛应用。

7、基于原子和分子间作用机制，发展适合于探测不同时间尺度的蛋白质相互作用的方法，将为探索蛋白质复合体中弱相互作用这一难点问题提供技术支撑。

8、通过集成小角散射、X-射线晶体学、NMR、分子动力学模拟的方法解析复合体结构，避免了对复合体进行结晶，降低了复合体结构解析的难度。

（三）课题设置

课题一、适合于结构测定的蛋白质高效制备新技术研究

承担单位：

中国科学院上海有机化学研究所，复旦大学

课题负责人：

曹春阳研究员

经费比例：

23%

研究目标：

建立适合于结构测定的蛋白质高效制备技术体系，包括：

研制5个以上含不同标签的双融合表达载体，实现目标蛋白的高效表达与纯化；开发3种以上包涵体变复性体系，实现70％以上包涵体蛋白的体外复性；发展3种以上膜蛋白高效表达和纯化新技术。

运用上述技术体系实现80～100个新蛋白及复合体的制备，其中10～15个完成结构测定。

研究内容：

（1）发展基于HSQC的快速鉴定蛋白质折叠和聚集的方法，用于蛋白质及复合体制备过程的监控，使之适合结构测定。

（2）开发一系列便于操作的双融合表达载体，发展蛋白质高效可溶性制备与纯化新技术，实现目标蛋白快速表达与纯化。

（3）在已有包涵体双变性复性专利技术的基础上，筛选新的包涵体变性和复性工艺，提高专利技术的通用性，以解决包涵体变复性这一瓶颈问题。

（4）利用绿色荧光蛋白（GFP）以及FSEC技术，实现膜蛋白可溶性表达和检测。

并建立麦胚和盘基网柄菌等无细胞膜蛋白表达体系。

（5）通过多顺反子共表达策略构建载体，实现蛋白复合体共表达。

课题二、基于同步辐射的蛋白质和复合体三维结构测定新技术研究

承担单位：

中国科学院高能物理研究所，复旦大学

课题负责人：

董宇辉研究员

经费比例：

26%

研究目标：

提高X-射线晶体学结构测定的自动化程度，建立高效数据收集及结构解析平台。

发展3种以上基于同步辐射的X-射线晶体学结构测定新方法，包括：

结合小角散射技术的晶体衍射相位解析方法；建立集成X-射线晶体学、小角散射和NMR等技术解析蛋白质复合体结构的方法；发展硫元素和卤族元素反常散射方法。

上述新技术将能应用于上海光源的生物大分子晶体学实验站。

研究内容：

（1）发展自动样品操作技术，实现实验条件优化和数据采集、传输、处理的同步化，提高结构测定的自动化程度。

（2）利用小角散射得到的溶液状态下复合体外形，结合各组分结构，并借助分子动力学优化和NMR技术测定的相互作用界面，获得复合体结构。

（3）以小角散射得到的蛋白质低分辨形状为初始模型，结合密度修正等方法解决X-射线晶体学中的相位问题。

（4）利用本项目发展的自动化技术，快速确定长波长反常散射实验的最佳波长和数据采集策略，实现全新结构的解析。

课题三、蛋白质结构的核磁共振测定新技术与新方法的研究

承担单位：

中国科学院武汉物理与数学研究所，中国科学院上海有机化学研究所

课题负责人：

刘买利研究员

经费比例：

28%

研究目标：

发展6种以上NMR结构测定新方法，包括：

3种基于偶极相互作用和极化转移机制、同位素标记等提高灵敏度和分辨率的方法；基于投影重建的快速多维NMR新方法；建立弱相互作用和动力学研究方法；建立膜蛋白结构测定的NMR方法。

研究内容：

（1）发展基于偶极相互作用和极化转移机制的高灵敏度蛋白质NMR方法；利用选择性13C、15N和2H标记技术，提高NMR结构测定的蛋白质分子量上限。

（2）发展新的脉冲序列和相位循环方法，减少PR-NMR谱中的误差和伪峰；完善和优化PR-NMR重建算法，消除对强角峰引起的噪音信号，提高重建图谱的质量。

（3）发展基于CPMG、极化转移和化学交换等NMR实验方法，并结合变场强实验，用于蛋白相互作用的研究和中间过程的捕获。

（4）发展测定膜蛋白主链扭转角（Ψ、Φ）和原子核间距的新方法；借助液体NMR脉冲模块，建立适合研究不同运动特征的膜蛋白链段的极化转移方法，用于膜蛋白结构测定。

课题四、蛋白质制备与结构测定新技术在关键生物学问题中的应用

承担单位：

复旦大学，中国科学院上海有机化学研究所

课题负责人：

徐彦辉研究员

经费比例：

23%

研究目标：

运用本项目建立的方法和现有技术，完成10～15个具有重要生物学意义的蛋白质或蛋白复合体的结构与功能研究。

研究内容：

通过以下蛋白质及蛋白质复合体的结构和功能研究来检验和优化本项目所发展的各种新技术和新方法：

（1）与疾病相关的蛋白质及其复合体结构研究：

与HIV病毒感染相关的Vta1及复合体Vta1NTD/Vps60，前列腺癌相关蛋白复合体LSD1/JMJD2C/AR，与红斑狼疮有关的OSCP蛋白及复合体；

（2）与膜相关的重要蛋白质及复合体结构研究：

革兰氏阴性菌外膜蛋白运输核心-Yaet复合体，对细胞极性的产生及维持起关键作用的PAR-3/PAR-6/aPKC大型复合体；

（3）与核酸相互作用的重要蛋白质及其复合体：

对神经元基因表达起负调控作用的NRSF/REST蛋白复合体等。

（四）课题之间的相互关系

本项目将集中布局突破蛋白质结构研究的两个主要瓶颈，即蛋白质的高分辨结构测定和高效制备。

针对蛋白质高效制备技术，课题一主要采取目前最常用的原核表达系统，一方面发展各种可溶性表达策略，另一方面对不可溶表达的包涵体进行变复性技术的开发，此外还将发展无细胞翻译等膜蛋白制备技术。

课题二和课题三将分别发展基于同步辐射的X-射线晶体学和核磁共振波谱学测定蛋白质结构的技术。

上述这些技术将在课题四的若干具有代表性和重要生物学功能的蛋白质和蛋白质复合体的研究中得到充分的验证和应用。

研究的重点突破方向是课题二和课题三，课题二适合蛋白晶体的结构测定，而课题三适合难于结晶的蛋白质结构测定和蛋白相互作用研究，这两个课题互相融合，相互补充，课题一的成果将会应用到突破性方向上，课题四是对整个技术体系的应用拓展、验证和优化。

各个课题之间在内容上紧密联系，相互支持。

四、年度计划

年度

研究内容

预期目标

第

一

年

1）开展基于HSQC的快速鉴定蛋白质折叠和聚集方法的研究。

2）开发便于操作的双融合可溶表达载体，开展新的包涵体变性和复性工艺的研究。

3）开展蛋白质高效可溶性制备与纯化技术、蛋白选择性13C、15N和2H标记技术的研究。

4）开展晶体样品的装配，切换和保存的自动化方法、晶体衍射数据采集、处理和存储的同步化方法的研究。

5）进行同步辐射光子位置探测器设计和加工。

开展用同步辐射小角散射测定溶液中蛋白质形状的方法研究。

6）利用固体NMR的极化反转技术和偶极滤波技术，压制单键的近程相互作用，有效观测13C、15N全富集膜蛋白样品的长程相互作用。

探索测量膜蛋白主链扭转角Ψ和Φ的脉冲实验方法。

7）建立NMR解析溶液蛋白质结构平台，开展基于偶极相互作用和极化转移机制提高蛋白质NMR灵敏度和分辨率的方法研究。

8）开展PR-NMR快速样品数据采集方法、实验数据的自动和准确采集方法研究。

9）开展针对与疾病相关的蛋白质及其复合体的功能研究和大量样品制备方法研究，进行初步晶体学筛选及NMR多维谱的采谱工作。

拟选择的蛋白质包括：

与HIV逆转录病毒感染相关的蛋白Vta1及复合体Vta1NTD/Vps60；与前列腺癌相关蛋白复合体LSD1/JMJD2C/AR；与系统性红斑狼疮有关的OSCP蛋白及其复合体。

1）实现完成HSQC快速鉴定方法，并用于蛋白质及复合体（10个）在溶液中的折叠和聚集状态的快速探测。

2）获得2-3个便于操作的双融合可溶表达载体，制备出3-5种蛋白样品；实现蛋白质13C、15N和2H标记技术；开发出1种新的包涵体双变性复性方法，制备出2-3种蛋白样品。

制备的5-8种蛋白中有1-2种用于结构测定。

3）实现同步辐射蛋白质晶体衍射样品操作全自动化；实现数据采集、处理和存储的同步化。

4）初步实现同步辐射小角散射测定蛋白质溶液形状的实验技术，包括相应的实验硬件和数据处理软件，并在北京和上海的同步辐射装置上试用。

5）完成同步辐射光子位置探测器的设计和加工，开始性能测试。

6）建立利用极化转移机制提高灵敏度和分辨率的NMR方法。

实现PR-NMR基本脉冲序列、数据的自动采集和图谱重建程序。

7）完成5-8个蛋白质、蛋白质复合体的大量制备用于结构生物学研究。

完成1-2个蛋白质、复合体的结构解析和功能研究工作。

8）发表SCI论文5-10篇,申请1-2项中国发明专利。

第

二

年

1）完善基于溶液蛋白质HSQC的快速鉴定蛋白质折叠和聚集的方法。

2）继续开发便于操作的双融合表达载体的研究；通过多顺反子共表达策略构建载体，实现蛋白复合体共表达。

继续研发新的包涵体变性和复性工艺；优化蛋白质高效可溶性制备与纯化新技术。

3）开展利用麦胚和大肠杆菌等无细胞抽提物进行膜蛋白的体外合成的方法研究。

4）结合小角散射和X-射线晶体学的相位解析技术中密度修正算法研究；结合小角散射和X-射线晶体学、NMR等方法测定复合物溶液结构的算法研究。

5）同步辐射光子位置探测器性能测试和优化；同步辐射束线自动化调节。

6）通过CPMG及变场强实验观测蛋白处于s-ms范围的运动过程。

区分构象转换的快慢过程，并识别配体结合过程中的过渡态。

发展和完善解析蛋白质结构的高灵敏度和高分辨NMR技术；发展和完善膜蛋白结构的固体NMR方法研究。

7）完善和优化PR-NMR基本脉冲序列、数据的自动采集和图谱重建程序。

8）利用本课题建立的新技术新方法，继续进行与疾病相关的蛋白质、蛋白质复合体的结构解析工作。

9）开始进行蛋白质与核酸复合体的功能研究和大量样品制备方法研究，进行初步晶体学筛选及NMR多维谱的采谱工作。

拟选蛋白质包括神经元发育相关的蛋白NRSF/REST及其与核酸形成的复合体、DNA修复相关复合体、组蛋白修饰复合体。

1）建立溶液蛋白质折叠和聚集监控方法的标准操作规程。

2）获得2－3个便于操作的双融合表达载体，制备15－18种蛋白样品；开发出第2种新的包涵体双变性复性体系，制备5－8种蛋白样品。

所制备的20-26种蛋白样品中有4-6种用于结构测定。

3）完成相位解析技术的理论体系，并形成软件在北京同步辐射装置试用；建立小角散射、X-射线晶体学、NMR综合研究复合体溶液结构的方法，包括相应的实验技术和数据处理软件，并在北京和上海的同步辐射装置上试用。

4）研制的同步辐射光子位置探测器工作性能要满足北京和上海两个同步辐射装置上束线控制和反馈的精度要求（精度10微米）。

初步实现同步辐射束线的自动化调节（调节时间由计算机完成，时间由1小时缩短到10分钟）。

5）提出改善PR-NMR新思路，编写出新的脉冲序列和相位循环，并进行实验验证。

实现基于CPMG/DOSY的脉冲方法，用于蛋白相互作用的研究和中间体的捕获。

6）实现测量膜蛋白几何参数的固体NMR脉冲方法。

7）完成20-26个蛋白质、蛋白质复合体的大量制备用于结构生物学研究。

得到8-10个适合结构测定的蛋白质、蛋白质复合体样品。

完成4-6个蛋白质、蛋白质复合体的结构测定。

其中单个蛋白的结构3-4个，复合体结构1-2个。

完成获得结构的蛋白质构效关系的分析。

8）发表SCI论文15-20篇（其中本领域公认重要刊物论文或IF>10论文1-2篇；申请中国发明专利2-4项；培养研究生3-8人。

第

三

年

1）推广应用溶液蛋白质折叠和聚集的监控方法。

2）继续开发便于操作的双融合表达载体。

优化蛋白质高效可溶性制备与纯化新技术；优化包涵体变复性技术，提高包涵体双变性复性专利技术的通用性。

完善无细胞翻译技术用于膜蛋白的制备。

3）开展长波长反常散射实验技术的研究。

开展分子动力学计算优化溶液中复合体结构以及NMR方法测定复合体界面结构的研究。

4）集成小角散射和X-射线晶体学解析相位技术的完善。

优化同步辐射束线自动化调节系统，建立监测反馈系统。

5）利用不同强度的高磁场（800-500MHz）测定弛豫速率T1/T2和异核NOE以获取蛋白质主链的动力学参数。

并将其用于研究蛋白复合体的相互作用。

6）继续开展膜蛋白固体NMR的方法研究，用于测量膜蛋白主链扭转角Ψ和Φ。

继续开展适用于蛋白质结构解析的高效NMR方法研究。

优化PR-NMR方法，探索PR-NMR在蛋白质相互