壳聚糖基卡托普利的合成及其释药研究.docx

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壳聚糖基卡托普利的合成及其释药研究

壳聚糖基卡托普利的合成及其释药研究

　　摘要：

克服水溶性药物的突释现象，可减少给药次数，提高疗效.本研究以卡托普利为模型药物，壳聚糖为载体，采用耦合的方法，设计合成了壳聚糖卡托普利和壳聚糖赖氨酰卡托普利两种新的键连型壳聚糖基载药体系，产物结构经IR、1HNMR和MS表征；并测试了两种化合物在PBS缓冲溶液（pH=7.4）和HCl-KCl缓冲溶液（pH=1.2）中72h的累?

e释药率：

壳聚糖卡托普利的累积释药率分别为59.2%和78.4%，壳聚糖赖氨酰卡托普利的累积释药率分别为55.2%和76.4%.结果表明，两种键连型载药体系均消除了突释现象，具有很好的缓释效果，这将有望成为水溶性药物的理想载药体系.

　　关键词：

卡托普利；壳聚糖；合成；缓释

　　中图分类号：

TB383文献标志码：

A

　　Abstract：

Inordertoovercometheburstreleaseofwater-solubledrugs，reducedosingfrequencyandimprovecurativeeffect，twonewbond-linkingtypedrug-loadedcontrol-releasingsystems：

Chitosan-CaptoprilandChitosan-Lysyl-Captoprilweresynthesizedfromcaptoprilasamodeldrugandchitosanascarriers.TheproductswerecharacterizedbyIR，1HNMRandMS.TheaccumulationofdrugreleaseratesofChitosan-Captoprilare59.2%inPBSbuffer（pH=7.4）and78.4%inHCl-KClbuffer（pH=1.2）.TheaccumulationofdrugreleaseratesofChitosan-Lysyl-Captoprilare55.2%inPBSbuffer（pH=7.4）and76.4%inHCl-KClbuffer（pH=1.2）.Theresultsshowthatthetwokindsofdrug-loadedsystemseliminatethephenomenonofburstreleasingandhaveexcellentsustainedreleaseproperties，whichareexpectedtobecometheidealcontrol-releasingsystemofwater-solubledrugs.

　　Keywords：

captopril；chitosan；synthesis；slow-releasing

　　卡托普利是一种有效的血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂，用于治疗高血压和充血性心脏衰竭[1].但游离态的卡托普利容易氧化[2]，且由于卡托普利的水溶性较好导致其生物半衰期仅为1.6～1.9h，需要日服3～4次，摄入总量达到37.5～75.0mg[3].临床上为了保持有效治疗浓度，通常采用增加剂量以延长体内作用时间，从而导致“波峰波谷”现象，可能引起眩晕、头疼、胃肠道紊乱等不良反应.因此，通过控制药物释放速率来减少峰谷差异及给药次数，减轻不良反应的意义重大.

　　目前，调节卡托普利释放速率的方式主要是将其制成包衣片、微丸或微囊等缓释剂型[4]：

1）将卡托普利与难溶于水的高分子化合物混合压缩成丸剂.如将卡托普利与羟丙基甲基纤维素，以及CaHPO4和PEG6000等辅剂混合均匀，然后压缩成小块[5].卡托普利的溶解速率决定于高分子化合物的疏水性、浓度大小等因素.2）在丸剂外再包一层难溶于水的高分子化合物做成包衣片.在卡托普利丸剂外再包一层乙基纤维素或羟丙基甲基纤维素等高分子化合物，该类包衣片的卡托普利释放速率主要依赖于包衣层的物理化学特性，如包衣层厚度、空隙大小和空隙率等[6].3）以介孔硅等无机纳米粒子作为固载材料，制备成微或纳囊[7].介孔硅的孔径及比表面积大小显著影响其载药量及卡托普利的释放速率.这些方法都降低了卡托普利的溶解速率，延长了释药时间，但也增大了卡托普利的氧化程度，因此，合成共价键联型卡托普利是解决易氧化及峰谷差异的最理想选择.

　　壳聚糖具有良好生物相容性和生物降解能力[8-9]，本文首次以壳聚糖为高分子骨架共价键联卡托普利，同时解决游离卡托普利的突释问题和易氧化问题；且基于赖氨酸具有预防心脑血管疾病产生的功效[10]，以其作为桥联基团，有利于进一步增强卡托普利的疗效.并对两种化合物在PBS缓冲溶液（pH=7.4）和HCl-KCl缓冲溶液（pH=1.2）中72h的累积释药率进行了初步研究.

　　1实验

　　1.1试剂与仪器

　　卡托普利：

99.5%，常州制药厂有限公司.EDC?

HCl：

98.5%，阿拉丁试剂公司.NHS：

98%，阿拉丁试剂公司.HOBt：

99%，阿拉丁试剂公司.DMAP：

99%，阿拉丁试剂公司.壳聚糖：

DD为98.87%（经微波间歇加热法脱乙酰处理），Mη为411KDa.其余试剂均为AR级，实验用水无特别说明均为蒸馏水.

　　液质联用仪：

Agilent1100型，美国安捷伦公司.红外光谱仪：

NicoletAvator360型，美国Nicolet公司.冷冻干燥机：

FD-1A型，北京博医康实验仪器有限公司.透析袋：

截留分子量8000～14000，北京鼎国生物技术责任有限公司

　　1.2实验过程

　　1.2.1壳聚糖卡托普利的合成　　称取卡托普利0.1086g、EDC?

HCl0.1150g、NHS0.069g、DMAP0.0122g于100mL三颈烧瓶中，将上述混合物用3mLDMF溶解，25℃搅拌活化4h.将0.12g（0.75mmol-NH2）壳聚糖用适量0.1M的盐酸溶解，加入活化溶液中，用三乙胺调节溶液的pH8～9，室?

叵路从?

48h，蒸馏水透析3d，冷冻干燥.产物为白色海绵状固体，产率46.2%.IR（KBr）：

3382.4cm-1（O-H和N-H混合伸缩振动），2973.5cm-1（CH3不对称伸缩振动），2925.3cm-1（CH2不对称伸缩振动），2880.2cm-1（CH3对称伸缩振动），1683.9cm-1（酰胺Ⅰ带C=O伸缩振动），1635.8cm-1（酰胺Ⅱ带N-H变形振动），1424.5cm-1（S-CH2特征吸收），1330.5cm-1（酰胺Ⅲ带C-N伸缩振动），1153.7cm-1（C-O-C伸缩振动），1080.1cm-1（壳聚糖C-N伸缩振动），755.1cm-1（C-S振动）.

　　1.2.2壳聚糖赖氨酰卡托普利的合成

　　中间体卡托普利酰赖氨酸的合成：

卡托普利0.1086g、EDC?

HCl0.1150g、HOBt0.081g、DMAP0.0122g混合于100mL三颈烧瓶中，用3mL蒸馏水溶解，25℃搅拌活化4h.将赖氨酸0.0658g用2mL蒸馏水溶解，加入活化溶液中，用NaHCO3粉末调节溶液的pH8～9，室温反应24h，无需分离提纯待用.

　　将EDC?

HCl0.1150g、HOBt0.081g、DMAP0.0122g用2mL蒸馏水溶解，加入到上述中间体溶液中，25℃搅拌活化4h.将0.12g（0.75mmol-NH2）壳聚糖用适量0.1M的盐酸溶解，加入活化溶液中，用NaHCO3粉末调节溶液的pH8～9，室温下反应48h，蒸馏水透析3d，冷冻干燥.产物为白色海绵状固体.IR（KBr）：

3391.8cm-1（O-H和N-H混合伸缩振动），2974.4cm-1（CH3不对称伸缩振动），2933.5cm-1（CH2不对称伸缩振动），2878.7cm-1（CH3对称伸缩振动），1683.3cm-1（酰胺Ⅰ带C=O伸缩振动），1635.6cm-1（酰胺Ⅱ带N-H变形振动），1457.4cm-1（CH2变形振动），1423.4cm-1（S-CH2），1385.6cm-1（CH3变形振动），1331.7cm-1（酰胺Ⅲ带C-N伸缩振动），1154.7cm-1（C-O-C伸缩振动），1078.3cm-1（壳聚糖C-N伸缩振动），751.4cm-1（C-S振动）.

　　1.2.3体外释药研究

　　用卡托普利配制0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L的系列标准溶液，在199nm处测定吸光度做出标准曲线.

　　称取两份25mg壳聚糖卡托普利放入透析袋中，分别加入5mLPBS（pH=7.4）缓冲溶液和盐酸氯化钾（pH=1.2）溶液，放入200mL与透析袋中液体相同的透析介质液中37℃恒温磁力搅拌（50r/min）透析，每隔一段时间取5mL缓冲液，同时补充同体积新鲜的透析介质，用UV-Vis紫外光谱仪测199nm处的吸光度，代入标准曲线中得浓度，并按式

（1）计算其累积释药率.同法进行壳聚糖赖氨酰卡托普利体外缓释率的测定.

　　式中：

V0为介质溶液的总体积；ct为释放各时间点测得介质溶液中的卡托普利浓度；V为每次取样的体积；W为待测样品的质量；X为测得样品的载药量.

　　1.3测试与表征

　　1.3.1壳聚糖卡托普利的结构表征

　　壳聚糖卡托普利的结构特点是卡托普利的羧基和壳聚糖的氨基形成酰胺键.与壳聚糖最明显的区别就是生成了酰胺键，这是证明目标化合物合成成功与否的重要标志.相比于壳聚糖，目标产物有很明显的酰胺键特征吸收峰出现，包括1683.9cm-1处的酰胺Ⅰ带C=O伸缩振动、1635.8cm-1处的酰胺Ⅱ带N-H变形振动、1330.5cm-1处的酰胺Ⅲ带C-N伸缩振动.巯基的吸收峰一般出现在2600～550cm-1的范围内，但一般很弱，有时候不出峰.但在1424.5cm-1处出现了S-CH2和755.1cm-1处的C-S特征吸收峰.综上所述，可以证明目标产物壳聚糖卡托普利的合成成功.

　　1.3.2壳聚糖赖氨酰卡托普利的结构表征

　　采用一锅法来合成目标化合物，关键是卡托普利酰赖氨酸中间体能成功合成，采集少量中间体经分离提纯用质谱表征，如图1所示.图1的MS：

343.8[M-1]+证明了卡托普利酰赖氨酸中间体的成功合成.

　　由于酰胺键在红外图谱中具有很特征的吸收峰，所以对产物进行了红外表征.相比于壳聚糖，产物壳聚糖赖氨酰卡托普利的红外图谱最明显的变化就是在1683.3cm-1处出现了很强的C=O伸缩振动吸收峰、1635.6cm-1处的N-H变形振动吸收峰和1331.7cm-1处的C-N伸缩振动吸收峰，这是酰胺的特征吸收峰，表明两种反应物之间发生了酰化反应.在1423.4cm-1处出现的S-CH2和751.4cm-1处的C-S特征吸收峰表明中间体成功接枝到壳聚糖上.综上所述，可以证明目标产物成功合成.

　　2结果与讨论

　　2.1壳聚糖卡托普利的合成

　　利用卡托普利的羧基和壳聚糖的氨基之间发生酰化反应，将卡托普利共价连接到壳聚糖上，合成壳聚糖卡托普利，合成路线如图2所示.　　一般而言，酰化反应都是在室温下进行，本文研究了室温下催化剂、pH值等条件对壳聚糖卡托普利合成产率的影响.当反应液pH为8，室温下反应24h，探索了催化剂（DMAP）对产率的影响，结果发现当DMAP存在时，产率为40.4%；而DMAP不存在时，产率仅为15.8%.DMAP对反应速率有很大的影响，这是因为DMAP结构上供电子的二甲氨基与吡啶环可以发生共振，能激活吡啶环上的氮原子进行亲核取代，显著地催化?

{位阻、低反应性的羧酸和胺的酰化反应.壳聚糖与小分子之间的反应本来就比较困难，一方面是由于壳聚糖在各种溶剂中的溶解度较低，另一方面，大分子与小分子在反应液中碰撞的几率很小，即接触面很小，这也导致反应进程减慢，所以DMAP在该反应过程中起到了很关键的活化作用.

　　由于壳聚糖的溶解度与pH有很大的关系，而壳聚糖的溶解度直接影响目标产物的生成，所以本文探索了pH对反应产率的影响，在研究pH对反应产率的影响过程中，均以DMAP为催化剂，室温下反应24h，结果发现：

当反应液pH为7时，产率为30.6%；pH为8时，产率为38.8%；pH为9时，产率为37.4%.当pH为7时，产率最低，可能是因为中性条件下，H+和OH-浓度最低，催化酰化速率慢，导致产率降低；当pH为9时，壳聚糖羟基和卡托普利羧基之间的酯化反应速率增大，与酰化反应构成竞争，导致目标产物产率降低.

　　2.2壳聚糖赖氨酰卡托普利的合成

　　壳聚糖赖氨酰卡托普利的合成是通过两次酰化反应来实现的，首先合成卡托普利酰赖氨酸中间体，然后再利用中间体的羧基与壳聚糖的氨基之间发生酰化反应，将卡托普利酰赖氨酸共价连接到壳聚糖上，合成路线如图3所示.

　　对卡托普利酰赖氨酸中间体的合成条件进行了优化：

25℃时，反应时间对产率的影响如图4所示.

　　从图4可以看出，反应时间越长，产率越高.但反应24h后继续延长反应时间，产率增大并不明显，且反应24h时的产率也仅为48.1%，说明直接缩合合成酰胺的反应速率较慢，综合产率和反应时间两个因素，得出最佳反应时间为24h.

　　一般而言，酰化反应都是在碱性的条件下进行的.况且我们用的缩合剂为EDC的盐酸盐，所以必须用碱将N上的盐酸盐中和掉，使其N游离出来，才能进行缩合.为了保证赖氨酸的氨基以游离的状态存在，反应也必须在碱性条件下进行，pH对反应的影响如图5所示.

　　由图5可以看出，最佳pH为8，当pH=7时，可能缩合剂的N没有被完全游离出来，导致缩合产率很低，当pH=9～10?

r，产率较pH=8有降低，但降低幅度并不大，所以弱碱性条件有利于该酰化反应进行，随着碱性增强，逆向水解反应速率逐渐增大，导致产率降低，所以强碱性条件不利于该反应.

　　2.3体外释药研究

　　为了模拟小肠和胃液环境，分别采用PBS缓冲溶液（pH=7.4）和盐酸氯化钾缓冲溶液（pH=1.2）作为释放介质.

　　壳聚糖卡托普利体外释放实验结果如图6所示.由图6可知，在PBS缓冲液（pH=7.4）中，在24h内，卡托普利的释放呈现良好的线性关系，48h以后，累积释药量增幅减小，这主要是因为水解接近平衡所致.在PBS缓冲溶液中72h累积释药率为59.2%.在盐酸氯化钾介质（pH=1.2）中壳聚糖卡托普利的释放行为与PBS介质中大致相同.在相同时间段的释药速度较快，72h的累积释药率达到78.4%.这是因为酰胺键在强酸性介质中更易水解，况且在酸性介质中，除了化学键的水解释放出药物分子外，还有壳聚糖分子链本身的水解，使药物分子失去了高分子链形成的保护网，加速了酰胺键的水解和水解后药物分子向外扩散，48h以后，增加幅度不大.

　　壳聚糖赖氨酰卡托普利体外释放试验结果如图7所示.由图7可知，在酸性和碱性介质中均具有很好的缓释效果，在两种介质释放的初始阶段，都没有出现很明显的突释现象.在pH为1.2的缓冲溶液中，48h内，卡托普利的释放呈现良好的线性关系，48h以后，累积释药量增幅减小，72h的累积释药率为55.2%.在PBS缓冲溶液中，72h的累积释药率为76.4%.

　　比较壳聚糖卡托普利和壳聚糖赖氨酰卡托普利的体外释放，可以看出，两种共价键联缓释载药体系在体外均具有很好的缓释效果，释放的初始阶段并没有出现很明显的突释现象，克服了微球和微胶囊易于出现突释的缺点，同时，也就不会出现“波峰波谷”现象.比较两种缓释体系同时间的累积释药率可以看出，壳聚糖赖氨酰卡托普利比壳聚糖卡托普利的要低，可能是因为化合物增加了一个酰胺键，更不易被水解的原因.

　　3结论

　　合成了壳聚糖卡托普利，产物经红外表征.对合成条件进行了优化，室温下在pH为8，有催化剂DMAP存在时，反应24h可得到较高的产率；合成了卡托普利酰赖氨酸中间体，对中间体的合成条件进行了优化，在25℃，pH为8的条件下，反应24h可得到较高的产率，采用质谱对其结构进行表征.再将该中间体对壳聚糖进行修饰，合成了壳聚糖赖氨酰卡托普利，产物结构经红外表征.研究了两种载药体系的体外释药性能：

壳聚糖卡托普利在PBS（pH=7.4）和HCl-KCl缓冲溶液（pH=1.2）中72h的累积释药率分别为59.2%和78.4%.壳聚糖赖氨酰卡托普利在PBS（pH=7.4）和HCl-KCl缓冲溶液（pH=1.2）中72h的累积释药率分别为55.2%和76.4%.两种载药体系均具有很好的缓释效果，这将有望成为水溶性药物的理想缓释系统.

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