曲师大酶工程.docx
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曲师大酶工程
第二章微生物资源开发利用的战略与策略
第二章微生物资源开发利用的战略与策略
第一节微生物资源开发的战略
1.开发意图贯彻始终
2.创新是灵魂
3.模型设计是关键
4.对同类型的微生物药物（生物活性物质）的开发
5.一菌多筛
6.关于混合菌
7.申请专利
第二节微生物资源开发的基本程序
第三节 各类微生物的分离
1.放线菌
2.细菌
3.真菌
第四节 资源微生物的保存
1.开发过程中的菌种及保存原则
2.资源微生物的长期保存方法
第一节微生物资源开发的战略
1.开发意图贯彻始终
开发意图是核心。
资源微生物的全程开发大体要有总体设计、收集样品、分离
菌种、筛选、小试、中试、产业化等阶段。
目的菌的要求：
产量高、活性强、生产性能好、无毒、不污
染环境、生产周期短等指标。
尽早找到目的菌是开发成败的关键。
一旦找到了目的菌，以
后的工作相对讲就比较好办了。
本章的中心就是探索达成此目的
的可能性及有关的途径。
2.创新是灵魂
微生物资源开发的真正兴起不过50年，开发潜力还很大。
一方面社会的新需求日益增加，新领域不断出现，随着科学技术
的不断进步，开发资源的能力也在增加。
另一方面，开发的难度
也大大增加，50年代从l000株菌就可找到一个新抗生素，现在
从一万株还未必能找到一个新抗生素。
据国外的统计，现在要从
一万个新化合物才有可能开发成功一个有临床价值的药物。
现在
已逐步形成一种新的看法：
新地方，新方法，新菌种，新模型，
新产物。
核心是不断革新，变换开发的策略。
例如改变分离菌种
的技术，可以从“老地方”分离到新菌种，开发成新的产品。
3.模型设计是关键
微生物资源开发的目的千差万别，但都必须建立准确、微
量、快速、简便的筛选模型。
尽早淘汰非目的菌，加速筛选进
程。
从下面的例子我们就可以发现模型设计的重要性：
高效筛选短芽孢杆菌的模型
β－内酰胺抗生素超敏感突变株的应用
4.对同类型的微生物药物（生物活性物质）的开发提出以下思路:
（1）假设要筛选的生物（植物、动物等）产生的天然药用成分（尤其
是抗生素）和部分人工合成的药物成分，在自然界的微生物中都有可能
找到（客观存在）。
（2）假设产生某类天然或人工合成药用成分的微生物，对这类化合
物都有抗性（这已经有许多证据）。
（3）采集产生某类药物的植物药用部位、或其根际土壤、或其他土
壤样品。
（4）将有关的药用成分大剂量（植物含量的l0—l000倍）加于微生物
分离培养基，选择性地分离样品中能耐受该化合物的微生物。
（5）对分离到的纯培养物或混合菌进行发酵，监测其药用成分。
（6）用入选的微生物生产新药物。
微生物药物的筛选阶段
微生物的次级代谢产物表现出众多的生物活性,最早被开发利用的
是抗生素。
到目前为止，抗生素的数量已有1万多个。
随着天然产物化学和病理学研究的深入，人们逐渐发现微生物产
生大量非抗生素类的生物活性物质，如下表所示:
筛选微生物药物（生物活性物质）关键在于如何建立一个高效、灵
敏的筛选系统，从有合成潜力的产生菌中发现有效的先导化合物，继
而开发为临床药物。
筛选流程可以如下图表示.
微生物药物（生物活性物质）的开发阶段
通过初筛和复筛，发现具有生物活性的微生物次级代谢产物，即
先导化合物（leadcompound）,经结构的修饰和药理活性筛选，获得安
全有效的候选化合物（candidate）；再进人临床前试验，包括动物试
验、毒性试验、药动学、副作用和作用机制的研究等，需要花费二到
三年时间；最后进入临床试验阶段。
与此同时，必须进行菌种的优
化，提高发酵效价，优化发酵和提取工艺，并放大到工业生产规模，
具体过程如下图所示。
微生物药物筛选模型的建立：
筛选模型是新药筛选中十分重要的因素之一，直接影响筛选的效
率和筛选的成果，世界各大制药公司的研究开发部均把筛选模型的研
究和开发作为新药研制的首要和关键任务，且相互保密。
一个理想的
筛选模型应具有对检测活性的灵敏性、选择性和有效性等特点，另外
还应该与人类疾病相关性好。
传统的抗生素筛选方法主要为检测体外的抑菌活性（与疾病相关或
不相关的）。
随着生物学科各种技术的发展，出现了很多更有效，更灵敏的筛
选方法，如：
定靶筛选方法
基于作用机制的筛选模型
目前常用的抗细菌、抗真菌和抗病毒抗生素的新筛选模型如下图
5.一菌多筛
尤其对于生物活性物质的开发，有时候，我们还不很清楚要找的
究竞是哪类微生物，而开发意图在分离菌种时无法贯彻，我们常常
要分离很多（甚至数以万）菌种。
这时如果只用一个或少数模型过筛，
往往找不到目的菌，造成大量浪费。
我们的经验是一菌多筛。
这不但
增加菌种的利用率和入选率，更重要的是有可能找到非目的（比如具有
某种活性）菌种，但用途更大的菌种，即所谓歪打正着。
这就需要开发
人员全局在胸，看得深远，通晓相关领域的动态。
同时还需要制定几
套开发方案。
6.关于混合菌
在微生物学发展的历程中，分离纯培养曾经是一个巨大的进步，
现代工业微生物发酵几乎都是纯种。
但是在一些情况下，资源微生物
的应用不一定需要纯培养。
如沼气发酵、矿石冶炼中的资源微生物。
7.申请专利
申请专利的件数是一个国家科技发展水平的重要标志之一。
资
源开发包含重大的经济利益，同时也包含重大的投入和风险。
资
源开发又是竞争很激烈的领域，开发者的意图、思路、策略和工
作进展都是严格保密的东西。
为了保护你的劳动成果，保护知识
产权，及时申请专利是绝对必要的。
专利是国家保护知识产权的
主要法律手段，微生物资源开发工作者必须运用好这个法律手段
以促进微生物资源开发工作的健康发展。
与此相关，如果你的
开发目标跟别人相重，而且别人占了上风（如在你之先申请了专
利），你就不得不及时改变战略，力争别处领先。
所以，一套好
的开发战略往往有几套方案。
<=Back
微生物资源全程开发的基本思路，一般是先从自然界找到目的
菌，然后改良菌株，进入生产。
有人采用诱导“沉默基因”开发
新产物的办法也属于资源开发的范畴。
微生物资源开发利用无非是利用微生物菌体本身，或其代谢产
物，或其某种特性或活性（如氧化或转化活性）或其总和。
尽早找
到目的菌是整个全程开发的中心环节。
一般的开发程序大体有以
下步骤：
第二节资源微生物开发的基本程序
试样的采集
（环境因素、天然及人工基质、微生物代谢类型等）
↓
产生菌的分离
（富集、预处理、抑制剂、培养基设计、培养条件等）
↓
初筛（选）
（产生菌的培养、发酵、模型设计、目的产物或性状的测定等）
↓
复筛（选）
（目的产物或性状的复核、产生菌工艺性状的考察）
↓
高产（高活性）
产生菌（野生菌）
↓
小型试验
（产生菌的最佳培养条件、生物学特性研究、菌种鉴定、工艺路线）
目的产物制备、目的性状、活性的测定、化学结构鉴定
（专利申请）
↓
毒性
（体外试验）
↓
大量制备→小型应用试验（专利申请）
体内试验、药理研究
↓
临床实验中间试验
（菌种选育、最佳工艺、临床实验、技术经济评价）
↓
工业性试验
（验证、修改、优化技术经济指标）
↓
产业化
我们要强调的是，这仅仅是全程研制和开发的一般思路。
目的的不
同，策略和部署都要随之改变。
我们主张跳跃式的思维，活用筛选策
略。
例如在复选甚至初选到一些目的菌以后，马上进行小试，并考察
目的菌的工艺性状，除了目的产物或活性（这是主要指标）之外，菌种
生长的快慢，孢子化程度，对营养要求的苛刻程度，抗病毒能力等相
关指标都要进行全面考察，以便对目的菌的生物学特性有一个较全面
的了解。
这些相关指标的考察往往不花多少时间和精力，但很有用，
能缩短筛选周期，因此宜早做。
如果只考虑目的指标，有时候到最后
才发现菌种的某个生产性能的指标（如生长慢、难培养、或副产物的干
扰、或感染噬菌体严重等）不好而被迫放弃，只好又从头做筛选，这种
教训经常发生，这就是首尾相顾的原则。
在此同时还要继续进行筛选
。
如果为了开发小分子生物活性物质，分离、纯化、鉴定目的化合物
，则是最优先的任务。
第三节各类微生物的分离
一、放线菌
为了研究不同环境条件下放线菌资源的分布，它们的数量和组
成，必须进行放线菌的分离。
放线菌分离的总的要求是：
尽可能让试
样中的全部放线菌都长出来，而其他微生物（细菌、真菌）又尽可能不
长。
为了达到这个要求，可以从以下几个方面来考虑：
一、根据不同类群放线菌的生理特性和营养要求，设计不同营养
成分，不同pH，添加不同抑制剂及其他特殊物质（维生素、激素等）的
多种培养基。
二、采用不同的培养条件，包括不同的培养温度、不同的培养时
间等。
三、对试样进行预处理。
样品的预处理
预处理的目的在于减少真菌、细菌的数量，增加放线菌（尤其是目
的放线菌）的数量，目前采用的新方法有：
①土样自然风干5至30天。
可大大减少细菌的数量，增加放线菌的出菌率；②风干土样在l20℃
干热处理1小时（潮湿的土样不能如此处理），可减少真菌、细菌的数
量，增加孢子放线菌的出现率。
二、细菌
跟其他微生物比较，细菌的生长更快，在通常情况下不必担心真菌
和放线菌的污染。
除了掌握第一节的原则外，分离资源细菌应注意以
下诸点:
（1）培养基成分以肉汤（膏）和蛋白胨为主。
（2）pH掌握在中性。
（3）如需抑制其他微生物的生长，可用50一100单位的放线菌酮或制
霉菌素。
三、真菌
分离一般真菌并不困难。
分离资源真菌应注意的问题是。
（1）以Martin琼脂和Czapek琼脂为基本培养基。
（2）pH一般在5左右。
如果为了使培养基的pH在4或以下，务必在中
性pH消毒倒平板时调pH至4以下。
（3）真菌菌落扩展很快，务必及时挑菌。
抑制剂使用
抑制剂使用得好，对目的菌的分离帮助极大。
一般来说，放线菌
酮、制霉菌素可抑制真菌；青霉素、链霉素可抑制细菌。
为了分离放
线菌，使用重铬酸钾，可以抑制细菌和真菌，而几乎不抑制放线菌。
第四节资源微生物的保存
具有现实或潜在用途或价值的微生物菌株都应该是保存的对象。
因
此从一开始分离到的菌株，一直到最后开发成功的优良高产菌株都应
该保存。
保存的目的在于维持微生物所固有的或生产所需要的性状。
但是，这不是说对任何菌都一视同仁，一样对待。
而应该根据菌种的
理论价值（模式菌种还是一般菌种）和生产价值或经济价值的大小、对
菌种的开发和认识程度的大小、菌种本身的生物学特性等采取不同的
保存方式。
与高等生物比较，微生物的遗传保守性较小。
这为我们改
变它们的遗传性状、提高产量提供了更大的可能性。
由于同样的原
因，菌种退化也是很难避免的。
因此，菌种保存是微生物资源开发很
重要的组成部分
一、开发过程中的菌种及保存原则
为了讨论的方便，我们把开发过程中的菌株定义如下：
从自然环境或人工环境分离到的菌株叫待筛菌株。
初筛得到的菌株
叫初入选菌株。
复筛人选的菌株叫人选菌株。
以上的菌株都是“野
生”菌株，没有经过人工育种。
经小试研究确定有应用（生产）前景，并且已经定名的菌株叫做专利
菌株（不申请专利）。
经过中试或已经投产的菌株叫生产菌株或优良菌
株（也有专利菌种）。
菌种开发程度的不同，保存的要求也应该有所区别。
1．待筛菌株
一般来说，待筛菌株的量都很大，不可能一下子筛选完。
但是筛选
过程最好不要超过半年。
为了使菌株在半年之内不致退化，一般可用
带螺帽（或橡皮塞）的试管斜面保存于4℃中。
我们前面曾经提到一菌多筛的原则。
在一个大的微生物资源开发集
体也不可能同时设置很多模型，也就是说待筛菌株需要保存较长时
间，以便先后经过多次筛选。
还有一种情况，就是《生物多样性公约》所说的“最好在遗传资源
原产国建立和维持移地保护及研究…..微生物的设施”。
这意味着凡
是有所不同的菌株都应该保存。
它们属于“有潜在价值”的微生物。
这些菌株数量巨大，大部分又未经定名。
保存这类菌株的目的在于永
久保存基因，为防止人类还不知道其存在之前就消亡的可能性。
另一
个目的就是为了在较长时间内研究和开发它们。
这也需要长期保存这
些菌种。
2.入选菌株
得到人选菌株以后马上就要进行小试。
小试的时间也可能较短，
也可能较长（几年）。
一般来说，人选菌株数量小。
保存的目的在于在
小试期间维持菌株的生产性能。
千万不能还没有完成小试，菌种已严
重退化，甚至于丧失生产能力。
对于入选菌株在小试过程中的使用及
保存应注意以下几点:
（1）尽量减少传代次数:
用长期保存方法（后述）保存菌种。
千万不能
长期相同斜面转斜面，一直转下去。
牛奶管（或甘油管）F1→代斜面种子（4℃保存的时间因菌而异）→
斜面菌种（实验用）
（2）在维持生产性能的前提下，调换斜面培养基成分。
最好不要永
远使用一种培养基。
（3）暂时复壮措施：
有的菌种（尤其是一些细菌）退化较快，在小试
期间又无力，也不一定有必要进行育种，可以采取以下简单方法防止
退化：
将菌株的悬浊液放人消过毒的土壤，维持50％一70％的湿度，
自然温度下一段时间。
再从土壤分离生产性能好的单菌落，转到斜面
上。
3．专利菌种和优良菌种
这两类菌种本身并无本质差别。
它们的数量少，一般都定名。
这
些菌种都无例外需要长期保存。
4．模式菌种
新种模式菌株一定得永久保存。
也可以委托法定的典型菌保藏中心
保存。
二、资源微生物的长期保存方法
1．砂土管保存
河砂洗净，80目孔过筛。
10%盐酸泡5小时，水冲洗至中性，烘干。
瘦（心）红土l00目过筛，水洗至中性，烘干。
砂：
土＝1：
1混合，装于指形管，20磅消毒1小时。
刮孢子或放孢子悬液于砂土内，常温抽干→指形管放进更大的试
管，放少量吸湿剂，塞橡皮塞或蜡封→存放于室温或4℃
用时直接挑取砂土接于斜面。
砂土管封存，仍可继续使用。
这种方法对于长孢子或芽孢的菌种效果较好，一般可保存3年左右，
且制备，保存，使用均方便。
但不适于保存无芽孢或无孢子的微生
物。
2．甘油保存
将20%（也可以用l00%）的甘油放入指形管，消毒。
刮菌体于其内。
-7
0℃（或-20℃）保存。
使用时从冰箱取出，慢解冻，接甘油悬液于斜面。
甘油管再放还-70
℃保存。
可反复用几次。
这种方法可保存3年左右。
这种方法制备简便，不长孢子的菌种亦可保存，使用也方便。
但需
-70℃冰箱。
3．麦麸保存
麦麸：
水＝1：
0．8，拌匀，分装于试管，约1—2cm厚，消毒。
接种
后，培养至孢子化完成。
室温抽干。
换橡皮塞或蜡封。
4℃或室温保
存。
使用时挑取少量麦麸于新鲜斜面。
原种可多次使用。
用这种方法保存真菌效果很好。
4．冻干保存
100mm×8mm的试管或安培管，放人打印的菌号标签．塞棉塞，消
毒。
牛奶脱脂或20%的牛奶粉水液脱脂，装于消毒试管0.2一0.5cm厚，
8磅消毒30分钟两次。
放入菌悬液。
冰冻干燥。
抽真空，火焰封口。
冰箱或室温保存。
这种方法的优点是保存时间可长达5年以上，生物活性不易丧失，操
作也简单。
问题是需要冰冻干燥设备
5．液氮保存
10%甘油水溶液注于培养好的菌种斜面，轻刮表面，作成菌悬液。
转
0．5m1菌悬液于无菌安培管，封口。
将安培管放于液氮冷冻器内。
冷却速度为l℃／分钟，使样品冷冻
到-35℃，然后温度可迅速降至-l96℃，并贮存之。
使用时，安培管在
常温慢解冻，然后转管。
这种方法的优点是保存时间长（5年以上），不
易失活。
但设备要求高。
课后习题：
一．设计试验方案：
筛选一株产（碱性、酸性或中性）蛋白酶（或淀粉酶或纤维素酶或其它酶）的（低温或高温或中温）微生物（细菌、酵母或丝状真菌）；
优化产酶条件；
得到该酶的纯组分；
克隆该酶的基因（至少用两种方法）。
Thanksforyourattention!
总体设计的要求
要求总体设计者提供如下4方面的信息：
1、研究意义
2、研究目标
3、研究方案
4、研究基础
题目要具有新颖性
题目是总体设计者要说的第一句话
1．研究意义
在这一部分，你应该说明开展此项工作的研究背景，分析以往研
究工作的进展和存在的问题，表明你将对哪一问题展开研究，或你在
工作中遇到了什么新问题和发现了什么新现象而需要进一步对它进行
研究，将所有这些信息资料收集全，对它分析，以此证明你对问题的
选择和分析是正确的。
若是新的研究领域，是否已有同行在开展工作
，他们的工作进展如何。
2.研究目标
准确、简明地表达你的研究目的，是项目总体设计者的精髓，它
必须具体、明确、可行，要准确地将你要做什么、希望能解决的问题
清晰地表达出来。
3．研究方案
写出合理、可行、具体、最佳研究方案。
对于研究中可能遇到的
困难，应有充分准备，并提出如何处理和解决这些可能出现的问题的
方案，不能掩饰这些困难。
4．研究基础
在这一部分你应该客观地阐述你以前做过什么工作，取得过什么成
绩（包括文章）。
一般来说，当你准备初稿时，应多问自己是否已按下述要求做到：
①立论依据是否充分，提出的问题是否属该研究领域的重要问
题。
②研究目的是否明确，研究内容是否合适，二者间是否一致。
③有关的文献资料是否已掌握全面，是否真正明白其中的问
题，是否熟悉该领域的研究进展，你提出的问题是否属于还未解
决问题，是否能为本研究领域增加新的内容和新的结论。
④前期的工作是否能说明你熟悉项目中采用的研究方法，是否能胜
任此项目的研究工作。
⑤研究方案是否能可行，是否创新，是否合适，是否清晰，是否能
令人信服，是否最佳，研究方法是否合适，是否可能会遇到困难，有
何补救措施，方法有何优点和不足。
应用领域
生物活性
典型化合物
作用靶位
临床
酶抑制剂
洛伐他汀
HMG-CoA还原酶
免疫抑制剂
FK-506
巨噬细胞和IL-2产生
免疫增强剂
乌苯类司
氨肽酶
受体拮抗剂
WF-11605
白三烯B4抑制剂
畜牧业
抗寄生虫
莫能星
球虫
avermectins
线虫
动物生长促进剂
bambermycin
促进饲料的利用
农业
杀昆虫剂
nikkomycins
几丁质合成酶
除草剂
herbimycins
单或双子叶植物
植物生长调节剂
gibberellins
植物
微生物产生的非抗生素类生物活性物质及其应用
<=Back
微生物产生的生物活性物质筛选流程
新生物活性化合物的综合评价（新药开发阶段）
<=Back
随着生命科学中各分支学科的快速发展及相互渗透，特别是分子生
化药理学和病因学的发展，使人们能够在分子水平上认识疾病发生的
生化过程，了解参与反应的各种分子，从而能够选择这些分子（如酶蛋
白分子）作为药物作用的靶位，建立起定靶筛选方法。
加之，分子遗传
学特别是基因工程技术的发展和应用，以及生物大分子的分离和纯化
技术，使筛选模型中的靶酶或受体分子能够分离出或化学合成，两者
的结合使定靶筛选方法能够在实际筛选中应用。
胆固醇生物合成酶抑制剂的筛选
我们已经得知胆固醇的生物合成途径，可以针对合成途径的某一个
酶建立定靶筛选方法，以HMG-CoA还原酶抑制剂美伐他汀（mevasta
tin）为阳性对照，筛选出了几种抑制胆固醇合成的微生物制剂。
定靶筛选方法
以DNA回旋酶为靶点的抗细菌药物初筛模型的建立
DNA回旋酶是细菌所特有,且在细菌多种生理过程中具有重要的作
用,所以建立以细菌DNA回旋酶为靶点的抗细菌药物筛选模型,有助于
筛选到高效、低毒、无交叉耐药的新一类抗生素,同时此模型还可用于
抗菌药物作用机制的研究和药物应用前景的评价。
喹诺酮类和香豆素类药物是DNA回旋酶的抑制剂。
前者作用于回
旋酶的A亚基,后者作用于B亚基。
主要的思路就是超敏感菌株的筛选，耐药性菌株的筛选和交叉耐药性的检验。
主要流程如下图
基于作用机制的筛选模型
筛选模型的另一个发展方向为：
根据现有药物的作用机制，建立
基于作用机制的筛选模型。
由于药理学和其他学科的发展，人们逐渐
认识传统药物的作用机制，如抗细菌的β一内酰胺类抗生素通过抑制
细胞壁的合成而抗菌，据此可以设计的筛选模型有:
细菌胞壁合成抑制
剂的筛选、DD-羧肽酶抑制剂的筛选及β－内酰胺酶水解敏感性的筛选
等。
胆固醇生物合成途径
以DNA回旋酶为靶点的抗细菌药物初筛模型的建立
类别
模型名称
作用靶位或机制
筛选应用
抗细菌抗生素
枝原体模型
细胞壁合成
azureomycinA.B
D一丙氨酸二肽合成抑制剂
消旋酶和二肽合成酶
阳性菌株
羧肽酶抑制剂
羧肽酶
N-acetylthienamycin
糖肽类抗生素的筛选
五肽的合成
阳性菌株
细菌DNA旋转酶抑制剂
细菌DNA旋转酶
CJ-12371,CJ12372
细菌叶酸代谢抑制剂
叶酸代谢
diazaquinomycinA
抗真菌抗生素
几丁质合成酶抑制剂
几丁质合成酶
nikkomycins
UDP一乙酰葡萄糖胺合成酶抑制剂
5－磷酸葡萄糖胺合成酶
提坦菌素
几丁质抑制剂
几丁质酶
allosamidin
（1.3）β－葡聚搪合成酶抑制剂
（1.3）β－葡聚糖合成酶
BU-3794E
抗病毒抗生素
HIV逆转录酶抑制剂
HIV逆转录酶
mniopetals
HIV蛋白酶抑制剂
HIV蛋白酶
GE20372A.B
HIV整合酶抑制剂
HIV整合酶
在开发中
gp120/CD4结合抑制剂
gp120/CD4特异结合
isochromophiloneIandI
抗细菌、抗真菌和抗病毒抗生素的新筛选模型及其应用
例一：
如何建立一个能高效筛选短芽孢杆菌的模型？
难题：
在基因工程的外源蛋白质表达中，常采用分泌表
达型受体，但现有的原核分泌表达系统，在进行外源蛋白高效
表达时易形成包涵体；产物分泌表达水平低,且常常分泌至周
质空间而不是真正的胞外，如何解决这个难题呢？
枯草杆菌具有良好的分泌性和非致病性,但胞外蛋白酶活
性较高，易引起产物降解。
短芽孢杆菌（Bacillusbrevis）不
仅分泌蛋白能力强而且胞外蛋白酶活性低,具有分泌表达外源
蛋白的天然优势,是分泌表达外源蛋白较理想的宿主，利用它
们可望建立一个高效的原核分泌表达系统。
所以我们先要建立
一个能高效筛选具有此两项要求的短芽孢杆菌的模型。
短芽孢杆菌的筛选流程
<=Back
？
例二：
寻找新的β－内酰胺抗生素
β－内酰胺抗生素的筛选自青霉素和头孢霉素问世以来
，二十多年未能再发现结构类型不同的新一类β－内酰胺抗生
素。
直到20世纪70年代，才有一系列新的β－内酰胺抗生素问
世。
究其原因，是由于这些天然存在的新β－内酰胺抗生素原
型的抗菌活性很低，或化学不稳定，或在发酵液中的浓度很
低，用过去的常规筛
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