消毒剂消毒效果验证文件V11.docx

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消毒剂消毒效果验证文件V11

公司质量管理体系文件

NO.:

VSF-02-037

消毒剂消毒效果验证文件

编制：

日期：

2011年月日

审核：

日期：

2011年月日

批准：

日期：

2011年月日

XXX生物科技有限公司

目录

1.验证方案制定及审批2

2.概述2

3.验证目的3

4.验证内容3

5.验证实施步骤3

6.验证主要依据11

7.验证合格标准11

8.再验证周期11

9.附件11

10.验证报告19

11.验证证书20

消毒剂消毒效果验证文件

1.验证方案制定及审批

验证项目

消毒剂消毒效果验证文件

验证小组

成员职务

姓名

部门

主要职责

组长

质量部

项目负责人

成员

质量部

方案实施责任人

生产部

方案实施人

质量部

检验员

验证方案

组织实施

进度

方案制定时间

年月日

方案实施时间

年月日

方案报告时间

年月日

起草人（签名）：

起草日期：

审查人（签名）：

审查日期：

批准人（签名）：

批准日期：

2.概述

洁净区用消毒剂对地漏、地面、墙面、操作台、设备表面及非灭菌容器具表面等进行消毒，旨在控制微生物污染水平，防止微生物在生产环境中污染及交叉污染，保证生产环境符合工艺卫生要求，最终保证产品质量。

本公司车间洁净区分为十万级、万级，所使用的消毒剂种类及使用对象如下图：

消毒剂名称

所使用对象

75%乙醇

移液器、设备表面、不锈钢操作台、手部

0.2%新洁尔溶液

地漏、地面、墙面、操作台、设备外表面、手部

0.1%醋酸洗必泰溶液

地漏、地面、墙面、操作台、设备外表面、手部

0.5%醋酸洗必泰溶液

地漏、地面、墙面、操作台、设备外表面、手部

我公司产品为分子诊断试剂，活菌数数量较大，为防止交叉污染，确认用此消毒剂消毒后生产环境内物体表面不残留控制菌和目的菌，保证我们使用的消毒剂能够对目的菌起到强抑制作用，能达到预期的消毒效果，必须对消毒剂的消毒效果进行验证。

本方案结合生物指示剂挑战性试验（特定菌挑战试验）和现场考察试验，对消毒剂的杀菌效力进行确认。

3.验证目的

确认洁净区按照规定的清洁、消毒程序进行清洁消毒后，能够达到防止交叉污染的目的，并在消毒有效期内能确保达到生产工艺所需要的效果。

4.验证内容

本验证先在实验室对所使用的消毒剂，用4种菌做中和剂鉴定试验，定量悬浮试验；然后做现场消毒考察实验，即现场消毒后用棉签取样法对消毒后的表面取样，做表面残留微生物限度检查。

通过对指示菌的杀灭对数值和现场消毒后洁净区表面微生物的残留限度来确认消毒剂的消毒效果。

5.验证实施步骤

5.1验证前准备：

在进行消毒剂消毒效果验证前，洁净厂房空气净化系统应经验证合格并正常运行，设备动力部应提供洁净厂房空气净化系统的验证报告、空气净化系统操作程序；与验证相关的各种设备、仪器均需通过相应验证，所需仪表、计量器具均需校验合格并具备校验证书。

5.2验证所需文件资料：

验证所需文件资料

资料名称

编号

活菌数检测操作规程

菌落计数操作规程

培养基配制操作规程

SOP-08-404

培养基配制、使用管理规程

SMP-08-011

消毒剂配制操作规程

消毒剂的使用操作规程

实验器具清洗操作规程

实验器具灭菌、消毒及使用操作规程

进出微生物限度实验室操作规程

QL-901型振荡器操作规程

BSA124S电子天平操作规程

DHP400型电热恒温箱操作规程

DHP400型电热恒温箱清洁规程

微生物实验室管理规程

SMP-07-307

PB-10计操作规程

SOP-02-011

检定菌管理规程

SMP-08-011

洁净区清场操作规程

设备清洁操作规程

5.3器材与试剂

5.3.1菌株

（1）细菌：

金黄色葡萄球菌

大肠杆菌

（2）细菌芽孢：

枯草杆菌芽孢

（3）真菌：

白色念珠菌

5.3.2培养基：

营养琼脂培养基

5.3.3稀释液：

0.9%无菌氯化钠溶液（NS）

5.3.4中和剂：

1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80

5.3.5无菌载片：

12mm直径圆形不锈钢片

5.3.6无菌试管

5.3.7无菌平皿（90mm）

5.3.8含玻璃珠的无菌三角瓶

5.3.9消毒剂：

75%酒精，0.2%新洁尔灭，0.1%醋酸洗必泰，0.5%醋酸洗必泰

5.3.10移液器及配套无菌吸头:

0-100ul，100-1000ul

5.3.11计时器

5.3.12超净工作台

5.3.13电动混合器

5.3.14恒温培养箱

5.3.15人工菌落计数器

5.4中和剂鉴定试验

5.4.1试验目的

通过该试验，确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用，对试验用菌剂及其恢复期培养示范有害或不良影响

5.4.2菌液的制备及计数

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌、白色念珠菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时。

取上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成1×108-5×108CFU/ml的工作菌液。

计数时，将1×108-5×108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀释成含50～100CFU/ml菌液，并同时采用营养琼脂培养基30～35℃培养2天计数。

计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。

5.4.3鉴定试验操作

5.4.3.1配制75%乙醇、0.2%新洁尔灭溶液、0.1%醋酸洗必泰、0.5%醋酸洗必泰。

将配置好的消毒剂置20℃±1℃恒温水浴锅中备用。

5.4.3.2分组操作

试验分组及稀释操作方法简表

组号

混合液A

混匀作用

10min

混合液B

混匀作用

10min

取混合液B或混合液B的稀释级溶液0.5ml平板计数（2皿/组）

取0.5ml工作菌液加入下列溶液中

取混合液A0.5ml加入下列溶液

1

消毒剂4.5ml

稀释液4.5ml

混合液B、10-1

2

消毒剂4.5ml

中和剂4.5ml

混合液B、10-1

3

中和剂4.5ml

稀释液4.5ml

10-2、10-3

4

中和产物4.5ml（消毒液与中和剂比例为1:

1）

稀释液4.5ml

10-2、0-3

5

稀释液4.5ml

稀释液4.5ml

10-2、10-3

6

稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。

具体操作

●第1组

目的：

观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。

操作：

取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min，取0.5ml注皿，平行制备2皿。

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置23～28℃培养5天计数计数。

●第2组

目的：

观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。

操作：

取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml+中和剂4.5ml，混匀作用10min，用稀释液稀释成10-1。

分别取未稀释溶液（混合液0.5mll+中和剂4.5ml的混合液）及10-10.5ml注皿，各平行制备2皿。

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置于23～28℃培养5天计数。

●第3组

目的：

观察中和剂是否有抑菌性

操作：

取中和剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5mll+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。

取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数计数。

●第4组

目的：

观察中和产物，或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。

操作：

取消毒剂和中和剂1:

1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。

取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计。

●第5组

目的：

作菌落数对照用

操作：

取稀释液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。

取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数。

●第6组

目的：

作为阴性对照用

操作：

分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。

结果判断

试验结果应符合下列全部条件，判断所选中和剂合格。

●第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。

●第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少，且符合下表要求

第1组平板平均菌落数

第2组平板平均菌落数

0

〉5

x

〉（x+5）

y

〉（y+0.5y）

●第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过15%。

计算公式如下：

（3组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和

误差率＝————————————————————————×100％

3×3组间菌落平均数

第6组无菌生长。

否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。

5.4.3.3结果记录

附件1：

中和剂鉴定试验结果记录

5.5定量悬浮试验

5.5.1试验目的

由于0.2%的新洁尔灭溶液、0.1%醋酸洗必泰溶液、0.5%醋酸洗必泰溶液是通过浸泡或液封消毒，通过定量悬浮试验，确定其消毒效力是否符合要求。

5.5.2试验操作

5.5.2.1配制0.2%的新洁尔灭溶液、0.1%醋酸洗必泰溶液、0.5%醋酸洗必泰溶液，操作执行《清洁剂和消毒剂管理》。

将配置好的消毒剂置20℃±1℃恒温水浴锅中备用。

5.5.2.2由于0.2%的新洁尔灭溶液中低效消毒剂，且不能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌。

0.1%醋酸洗必泰、0.5%醋酸洗必泰溶液为高效消毒剂，能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌枯金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌。

5.5.2.3将菌液制备成1×108~5×108CFU/ml的工作菌液，菌液的制备及计数同上。

5.5.2.4将试管按需要分组排列在试管架上，试验组分3组（4min、5min、6min各一组），并由左向右逐管标明消毒剂、中和剂、10-1、10-2。

对照组分1组，并由左向右逐管标明稀释液、中和剂、10-1、10-2、10-3、10-4。

。

5.5.2.5向个试管加入4.5ml相应的试剂，标明10-1、10-2、10-3、10-4。

加入4.5ml的稀释液。

5.5.2.6吸取工作菌液0.5ml加入标明消毒剂的试管中，对照组加入标明稀释液的试管中，迅速混匀，并开始计时。

5.5.2.7待菌液与消毒剂相互作用至8min、10min、12min，吸取菌液和消毒剂混合液0.5ml，加入标明中和剂的试管中，迅速混匀。

5.5.2.8中和作用10min后，吸取0.5ml加入标明10-1的试管中，混匀后吸取0.5ml加入标明10-2试管中（对照组以此类推，对照组直至10-4）。

5.5.2.9试验组分别取中和剂管、10-1、10-2管溶液1ml按平皿法测定存活菌数；对照组取10-3、10-41ml按平皿法测定存活菌数。

每管平行制备2皿。

5.5.2.10金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置于23～28℃培养5天计数计数。

5.5.3结果计算

计算试验组和对照组的活菌浓度 （CFU/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值:

杀灭对数值 （KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（NO）－试验组活菌浓度对数值（NX）

5.5.4可接受标准

杀灭对数值 （KL）应不低于3~5个对数单位。

附件2：

定量悬浮试验结果记录

5.6现场考察试验

5.6.1消毒剂的配制：

洁净区操作人员按照《消毒剂的配制和使用操作过程》（SOP）配制75%酒精、0.2%新洁尔灭、0.1%醋酸洗必泰，0.5%醋酸洗必泰

5.6.2生产结束后操作人员按照生产车间区清洁SOP对洁净区进行清洁消毒。

5.6.3清洁消毒完毕15分钟后，现场QA使用棉签取样法对清洁消毒后的洁净区进行表面微生物监测取样，共测定3次。

5.6.4取样点的确定：

各洁净区十万级抽取二个操作间；万级抽取两个操作间。

选择操作间的墙面、地面、设备外壁以及操作台最难清洁的地方作为取样点。

附件3表面微生物监测位点。

5.6.5取样面积：

25cm2

5.6.6取样方法：

棉签取样法

5.6.7取样程序：

a样人员用经过灭菌处理的生理盐水润湿经过灭菌处理的棉签，并将其靠在溶剂瓶上挤压，以除去多余的溶剂；

b棉签按在取样表面上，用力使其稍弯曲，按图A，平稳而缓慢地擦拭取样表面。

在向前移动的同时将其从一边移到另一边。

擦拭过程应覆盖整个表面。

翻转棉签，按图B，让棉签的另一面也进行擦拭。

但与前次擦拭移动方向垂直，见下图：

图A图B

c.擦拭完毕后，将棉签放入试管中，并加盖密封。

d.向试管中加入10ml灭菌后的生理盐水，振摇10分钟。

e.空白样品的制备：

按以上第二步湿润棉签，将棉签直接放入试管并加盖密封。

f.取样完成后，在试管上注明有关取样信息、编号，并做好取样记录。

g.所有样品送质检室进行检测。

5.6.8检测方法：

将取样后的纱布或脱脂棉放入广口瓶中，加一定量的浸出液（10ml灭菌生理盐水）充分振摇10分钟，按微生物检查法进行检测。

同时做空白对照试验。

5.6.9测定结果记录

附件4：

洁净区表面微生物监测结果记录

5.6.10合格标准

洁净级别

表面菌落数（非地面）

表面菌落数（地面）

100级

＜1cfu/皿

≤3cfu/皿

10000级

≤5cfu/皿

≤10cfu/皿

100000级

≤15cfu/皿

≤30cfu/皿

6.验证主要依据

6.1《药品生产验证指南》

6.2《消毒技术规范》（2008年版）

6.3《中国药典》（2010年版）

7.验证合格标准

7.1生物指示剂挑战性实验判定合格标准：

消毒剂对挑战菌的杀灭对数值≥3判为合格。

7.2现场考察试验合格标准

洁净级别

表面菌落数（非地面）

表面菌落数（地面）

100级

＜1cfu/皿

≤3cfu/皿

10000级

≤5cfu/皿

≤10cfu/皿

100000级

≤15cfu/皿

≤30cfu/皿

8.再验证周期

8.1当消毒剂的使用浓度和清洁消毒程序发生变更时应进行再验证。

8.2当环境中出现新类型的微生物时，应以该微生物为挑战菌进行再验证。

8.3当有新的消毒剂被使用时应进行验证。

9.附件

附件1

中和剂鉴定试验结果记录

消毒剂

菌株

各组回收菌落平均数

3、4、5组平均数

3、4、5组误差率

75%乙醇

大肠杆菌

1

2

3

4

5

6

金黄色葡萄球菌

白色念珠菌

枯草芽孢杆菌

0.1%新洁尔灭

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

白色念珠菌

枯草芽孢杆菌

0.1%醋酸洗必泰

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

白色念珠菌

枯草芽孢杆菌

0.5%醋酸洗必泰

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

白色念珠菌

枯草芽孢杆菌

检测人：

复核人：

年月日年月日

附件2-1

定量悬浮试验结果记录

消毒剂

菌株

灭菌时间（min）

稀释倍数

结果计数

杀灭对数值（KL）

备注

10-1（对照组10-3）

10-2（对照组10-3）

75%乙醇

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

白色念珠菌

枯草芽孢杆菌

检测人：

复核人：

年月日年月日

附件2-2：

定量悬浮试验结果记录

消毒剂

菌株

灭菌时间（min）

稀释倍数

结果计数

杀灭对数值（KL）

备注

10-1（对照组10-3）

10-2（对照组10-3）

0.2%新洁

尔灭溶液

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

白色念珠菌

枯草芽孢杆菌

检测人：

复核人：

年月日年月日

附件2-3：

定量悬浮试验结果记录

消毒剂

菌株

灭菌时间（min）

稀释倍数

结果计数

杀灭对数值（KL）

备注

10-1（对照组10-3）

10-2（对照组10-3）

0.1%醋酸

洗必泰溶液

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

白色念珠菌

枯草芽孢杆菌

检测人：

复核人：

年月日年月日

附件2-4：

定量悬浮试验结果记录

消毒剂

菌株

灭菌时间（min）

稀释倍数

结果计数

杀灭对数值（KL）

备注

10-1（对照组10-3）

10-2（对照组10-3）

0.5%醋酸

洗必泰溶液

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

白色念珠菌

枯草芽孢杆菌

检测人：

复核人：

年月日年月日

附件3

表面微生物监测位点

操作间

取样点

洁净级别

十万级配制一室

操作台

十万级

设备外表面

十万级

墙面

十万级

十万级包被一室

操作台

十万级

设备外表面

十万级

墙面

十万级

万级配制一室

操作台

万级

设备外表面

万级

墙面

万级

万级分装一室

操作台

万级

设备外表面

万级

墙面

万级

万级质检微生物检验室

操作台

万级

设备外表面

万级

墙面

万级

附件4

洁净区表面微生物监测结果记录

年月日

操作间

取样点

洁净级别

平均菌数

第一次

第二次

第三次

十万级配制一室

操作台

十万级

设备外表面

十万级

墙面

十万级

十万级包被一室

操作台

十万级

设备外表面

十万级

墙面

十万级

万级配制一室

操作台

万级

设备外表面

万级

墙面

万级

万级分装一室

操作台

万级

设备外表面

万级

墙面

万级

万级质检微生物检验室

操作台

万级

设备外表面

万级

墙面

万级

检测人：

复核人：

年月日年月日

10.

验证报告

验证报告

验证实施

概要

验证结果

小结

结论

11.验证证书

验证证书

经审核，验证方案合理，验证结果符合规定，

特此发给验证证书，批准“”投入使用。

批准人：

日期：