毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒.docx

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白

综述：

基本特征：

作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：

如蛋白加工、折叠、翻译

后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：

许多技术可以通用：

互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：

His4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野

生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如His4、Leu2、Arg4、TR11、Ura3等基因

在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：

毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：

醇氧

化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要

在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

由于

醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。

而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

两种醇氧化酶蛋白：

毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。

细胞中大多数的醇氧化酶是

AOX1基因产物。

甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性

蛋白的30%以上。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

表达：

AOX1基因的表达在转录水平受调控。

在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+RNA

来自AOX1基因。

AOX1基因调控分两步：

抑制/去抑制机制加诱导机制。

简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。

为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。

注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。

AOX1突变表型：

缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株

（methanolutilizationslow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。

结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。

Mut+（methanolutilizationplus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。

这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。

蛋白胞内及分泌表达：

外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。

分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将

外源蛋白靶向分泌通路。

几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分

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制作者：

陈苗商汉桥

泌信号序列，利用酿酒酵母α因子前原肽信号序列也获得许多成功。

分泌表达外源蛋白的最大优点是：

毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最

小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成份，也可算作蛋白纯化的第一步。

注意，如果外源蛋白一级结构中有可识别的糖基化位点

（Asn-X-Ser/Thr）,则这些位点可能发生糖基化。

翻译后修饰：

与酿酒酵母相比，毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有优势，因为不会使其过糖基化。

酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型，然而毕赤酵母中蛋白转录后所增

加的寡糖链长度（平均每个支链8-14个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150个甘露糖残基）短得多。

另外，酿酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。

一般认为酿酒

酵母中糖基化蛋白的α-1,3聚糖接头与蛋白的超抗原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。

虽然未经证明，但这对毕赤酵母产生的糖蛋白不构成问题，因为毕赤酵母表达蛋白与高级真核生物糖蛋白结构相似。

选择载体用于基因多拷贝整合：

在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。

该试剂盒中

的三个载体均可用于在体内（pPIC3.5K,pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。

体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。

多拷贝插入频率：

毕赤酵母His+转化子高拷贝整合事件自发发生的概率为1－10%，体内方法可筛选可能

插入多拷贝外源基因的His+转化子，体外方法可通过连接构建多拷贝子。

当选择His+转化子时，它们中插入体外构建结构多聚体的概率很高。

体内多拷贝插入的产生：

Ppic3.5k及Ppic9k含有细菌kan基因，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，注意Kan并不赋予毕赤酵母卡那霉素抗性。

遗传霉素抗性水平主要依赖整合的kan基因的数目。

单拷贝Ppic3.5k或Ppic9k整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25mg/ml的遗传霉素抗性水平。

任何载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平，从0.5mg/ml（1-2拷贝）到4mg/ml（7-12拷贝）。

由于kan基因与表达盒（pAOX1及目的基因）之间有遗传连锁，可从遗传霉素高抗性推断该克隆所包含多拷贝目的基因数。

由于基因的剂量效益，蛋白的表达可能会增加。

因此，kan基因可检测转化子是否含有多拷贝目的基因。

下图显示多拷贝插入及kan基因与表达盒的连锁。

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制作者：

陈苗商汉桥

遗传霉素直接选择：

在酵母中对遗传霉素抗性进行直接选择并不十分有效，因为新转化的细胞需要时间表达

足够量的抗性因子。

由于酵母生长比细菌慢得多，大部分重组酵母在积累足够多的抗性因子

以抵抗平板上抗生素之前就已经被杀死了。

最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序

需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。

虽然可以用电泳进行直接筛选，但用在遗传霉素筛选之后再进行电泳筛选，获得含高拷

贝克隆的机会更大，大约可获得5-9拷贝的克隆，而直接电泳选择只能获得平均为1-3拷贝的克隆。

原生质转化时不能用遗传霉素直接选择。

体外多拷贝插入的产生：

下图显示如何产生多表达盒插入载体以转化毕赤酵母。

目的基因插入独个EcoRI位点

后，产生的表达盒（pAOX1及目的基因）上下游侧翼分别为独个的BglII及BamHI位点。

含目的基因的pAOX815用BglII及BamHI消化以分离表达盒，表达盒再插入BamHI

位点以产生串联重复表达盒，重复该插入程序可产生一系列含单个HIS4基因及逐渐增加数目表达盒的载体。

用体外形成的多拷贝子转化毕赤酵母增加了多拷贝表达盒重组子出现的频率，可设计包

含一特定数目多拷贝插入的毕赤酵母重组子。

转化及整合：

可产生两个不同表型的His+重组菌株：

质粒DNA线性化位置不同，转化GS115后可

产生两种转化子His+Mut+及His+Muts。

KM71只产生His+Muts，因为该菌株为Muts表型。

两种重组子Mut＋及Muts都是有用的，因为一个表型可能比另一个表型更有利于蛋白表达。

理想条件下，每一个表型应该检测6-10个重组子。

没有办法预测哪个结构或克隆更利于蛋白表达。

强烈推荐用PCR分析重组子来证实整合情况。

成功将基因构建至AOX1启动子下游后，线性化质粒转化毕赤酵母时激发重组。

下图

显示用不同酶消化时产生何种重组子。

限制酶插入事件GS115表型KM71表型

SalI或StuI插入his4His+Mut+、His+Muts

SacI插入5’AOX1His+Mut+、His+Muts

BglII取代AOX1His+MutsHis+Muts（不推荐）

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陈苗商汉桥

表达及扩大培养：

用PCR证实毕赤酵母重组后，可检测His+Mut+及His+Muts的表达。

小规模培养每个

重组子，用甲醇诱导，检测时间点.如果是胞内表达，每个时间点细胞沉淀用SDS-PAGE分

析;如果是分泌表达，分析每个时间点的细胞及上清。

如果有蛋白的抗体，推荐既用考马斯

亮蓝染色又用westernblot分析SDS-PAGE凝胶。

如果可以,建议检测蛋白活性。

因为并不是所有蛋白都能达到g/l的水平，所以建议进行westernblot或活性分析，不要仅做SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析。

如何选择最佳的表达蛋白毕赤酵母菌株及优化诱导见P49-50。

如表达已达最优，大规

模表达以产生更多蛋白。

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陈苗商汉桥

方法

毕赤菌株表型：

毕赤酵母菌GS115及KM71在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，

所有表达质粒都有HIS4基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。

GS115及KM71自发回复突变到His＋原养生物机率小于1/108。

KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中

不能生长。

用野生型ARG4基因破坏AOX1基因后，产生KM71MutsArg+His-菌株。

GS115及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。

转化之前，GS115及KM71都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。

KM71结构：

ARG4基因（约2kb）插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI（AOX1基因15/16密码子）及SalI（AOX1基因227/228密码子）位点。

ARG4取代了AOX1基因16－227密码子。

此结构转化至KM71亲本菌（arg4his4）中,分离Arg+转化子并分析Muts表型。

Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1:

:

ARG4结构所取代。

重点：

用KM71的优点是，不需要在甲醇最小培养基中筛选Mut表型。

所有转化子都是Muts

表型。

第二，AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换aox1:

:

ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长时需精氨酸。

不幸的是，仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4突变的影响，arg4菌株在含精氨酸的最小培养基中不能很好地生长。

因此不推荐在KM71中通过取代aox1:

:

ARG4结构来获得His＋转化子。

菌株表达对照：

GS115/His+Muts白蛋白：

该菌株为筛选毕赤酵母分泌表达转化子与Muts表型时的对

照。

血清白蛋白基因及其自身分泌信号被整合进毕赤酵母AOX1位点。

该菌株可分泌白蛋

白（67kDa）到培养基中，分泌水平＞1g/l。

GS115/His+Mut+β－半乳糖苷酶：

该菌株为筛选毕赤酵母转化子胞内表达与Mut+表型时的对照。

β－半乳糖苷酶（lacZ）基因被整合进毕赤酵母his4位点，该菌株表达β－半乳糖苷酶（117kDa），达到通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色或ONPG分析可测水平。

毕赤酵母菌株生长：

毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。

在32度以上诱导生长时，对蛋白

表达有害，甚至会导致细胞死亡。

另外注意点有：

1在YPD中，处于对数期的Mut+、Muts毕赤酵母倍增时间为2小时

2除了在甲醇中生长速度不同外，Mut+、Muts生长速度没有差别

3甲醇培养基（MM）中，处于对数期的Mut+倍增时间为4-6小时

4甲醇培养基（MM）中，处于对数期的Muts倍增时间为18小时

51OD600=5×107细胞/ml

注意：

生长特性依重组菌株不同而不同

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陈苗商汉桥

在甲醇中生长：

当使用甲醇平板或培养基培养时，建议每天添加甲醇以补偿甲醇挥发及消耗。

1平板培养时，在倒置平板盖中加入100ul100%甲醇

2液体培养时，加入100%甲醇至终浓度为0.5%养基或YPD琼脂

3部分研究者在进行液体培养时，对Muts菌株每天加甲醇至浓度为1%，对Mut+菌株每天加甲醇至浓度为3%时，对液体培养没有不良影响。

贮存：

贮存细胞几周或几月，用YPD培斜面

1挑取所需菌株单克隆在YPD平板上划线生长

2挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30度2天

3细胞在4度可放几周

几月或几年，存于－80度

1挑取所需菌株单克隆在YPD中过夜培养

2收集细胞，在含15%甘油的YPD中悬浮至终OD600为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）

3细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80度。

注意：

在4度或－80度长期保存后，用之前建议在MM、MD或MGY平板上划线培养

以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。

大肠杆菌菌株：

大肠杆菌菌株表型：

提供E.coliTop10F’以防没有合适的E.coli菌株。

其它合适的菌株

为DH5αF’，JM109或其它重组缺失菌株（recA），最好是endA，及带有选择性的F’附加体。

Top10F’适用于重组及单链拯救。

如果不需进行单链DNA拯救，也可用不含F’附加体的大肠杆菌菌株。

建议：

建议冻存Top10F’

1在5ml含50－100mg/ml四环素的LB中培养Top10F’过夜

2取0.85ml培养液加0.15ml灭菌甘油完全混匀

3转入冻存瓶中，冻在液氮或干冰/酒精浴中

4存于－80度

选择毕赤酵母表达载体：

选择载体：

如果目的蛋白是细胞溶质型且是无糖基化蛋白，可选择胞内表达蛋白。

如果目的蛋白是正常分泌、糖基化蛋白或直接分泌至胞内细胞器内，可尝试分泌表达目的蛋白。

建议用体内及体外方法产生并分离外源基因多拷贝插入子。

无法预测哪种方法适用于你

的蛋白，每种方法的优缺点如下：

体外方法pAO815

优点缺点

可构建特定数目的多拷贝子克隆特定数目多拷贝子需要更多工作大多数His＋转化子含有正确的特定数目插入载体可能会很大，与基因大小及插入拷贝数有关筛选多插入子很容易，因为大部分His＋转化子含有多拷贝目的基因在E.coli中可能会发生重排体外构建可以分析拷贝数对蛋白表达的影响多拷贝插入位于单一位点

载体上无需另外的药物抗性标记

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制作者：

陈苗商汉桥

体外方法Ppic3.5k或Ppic9k

优点缺点

开始实验比较容易，转化毕赤酵母前载体中只需克隆单拷贝基因定量筛选－遗传霉素抗性并不一定与基因拷贝数相关1-10%的His＋转化子有自发的多拷贝插入筛选His＋转化子需要做很多工作，因为要从成千上万个His＋转化子中才能筛选到足够多的遗传霉素抗性克隆进行检测载体平均大小与其它毕赤酵母表达系统相似多拷贝插入的数目不知（尽管可用southern或dotblot分析方法进行检测）多拷贝插入位于单一位点遗传霉素筛选对细胞密度敏感，可能会分离到假阳性

特点：

下表显示毕赤酵母多拷贝表达载体的一般特点及优点：

特点描述优点

5‘AOX1含AOX1启动子的约1000bp片段毕赤酵母中可实现甲醇诱导的高

水平表达α-factor信号序列编码α因子信号序列的269bp，用于毕赤酵母分泌表达（只能用于Ppic9k）分泌所需蛋白至培养基中MCS多克隆位点在表达载体中插入目的基因

TTAOX1基因自带的转录终止及polyA信号（约260bp）mRNA有效的转录终止及多聚腺苷酸化HIS4毕赤酵母野生型基因编码组氨酸脱氢酶（约2.4kb），用于与毕赤酵母his4菌株进行互补为选择毕赤酵母重组菌株提供选择标记3‘AOX1AOX1基因序列，在TT3‘远端序列（约650bp）质粒靶向整合进AOX1基因AmppBR322

复制起点Amp抗性基因E.coli复制起始用于选择、复制及维护E.coli，BamH，IbglII，

NotI，SacI，SalI，StuI单一酶切位点（StuI在Ppic3.5k或Ppic9k中不

是唯一的）可线性化载体，使有效插入毕赤酵母基因组产生Mut+或Muts重组子Kan来自Tn903的卡那抗性基因，赋予E.coli卡那基因抗性，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性（Ppic3.5k或Ppic9k）通过增加的抗遗传霉素抗性，可在体内筛选多拷贝插入子

在大肠杆菌中筛选Kan抗性菌株在该试剂盒中，任何毕赤酵母表达载体都没有酵母复制起始位点。

只有当质粒与毕赤酵母基因组发生重组时，才能分离到HIS＋转化子。

Ppic9k：

含卡那基因，体内筛选多拷贝子插入，分泌重组蛋白至培养基中。

在GS115

及KM71中有功能。

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制作者：

陈苗商汉桥

19276bp融合载体

2在α-factor分泌信号阅读框中含有用于克隆的4个单限制酶位点。

SnaBI、EcoRI、

AvrII、NotI

3α-factor分泌信号分泌表达目的蛋白。

表达时，目的基因必须克隆进信号序列起始密

码的读码框中

毕赤酵母HIS4筛选

GS115或KM71，在AOX1基因处插入，用SacI线性化（对于GS115产生His+Mut+，

对于KM71产生His+Muts）

在HIS4位点插入，用SalI线性化（对于GS115产生His+Mut+，对于KM71产生His+Muts）

在GS115菌株中，替换AOX1基因，用BglII线性化（产生His+Muts）

克隆进毕赤酵母多拷贝表达载体：

介绍：

下面列出用这些载体进行克隆策略时应考虑的方针。

考虑位点，如用Ppic9k载

体，应考虑将目的基因克隆进α-factor信号序列读码框中。

建议将3个超螺旋毕赤酵母表达载体转化E.coli，以便长期保存。

1用灭菌水或TE缓冲液稀释1ul质粒（1ug/ul）至10-100pg/ul

2取1-2ul稀释质粒转化感受态E.coli，在含50-100ug/mlAmp的LB平板上选择

一般考虑：

下面是应用pAO815、Ppic3.5k或Ppic9k时的一般考虑

1毕赤酵母的密码偏爱与酿酒酵母相同，已证明许多酿酒酵母中基因在毕赤酵母中有交

叉功能

2应在含recA,endA突变的E.coli菌株如Top10F’中构建质粒

3AOX1mRNA的5‘末端在各多克隆位点都已标注出。

如需分析RNA，可计算插入基

因mRNA的大小

4插入基因的终止密码子或3‘AOX1序列可使翻译有效终止，3‘AOX1序列终止密码

已标注出

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陈苗商汉桥

5在毕赤酵母及其它真核系统中均发现了“AT富含区”导致的转录提前终止。

如果表

达蛋白时出现问题，应检查是否是提前终止及AT富含区。

如要表达基因则需改变基因序列。

6Ppic9k中预测的蛋白酶裂解位点如图（p28）所示

7插入成熟基因的开放阅读框，应克隆进α-factor信号序列读码框的下游

一般克隆策略：

1连接适合的限制性片段

A直接插入MCS上两个不同位点

B利用相同的限制性末端，将片段连入单个合适位点

2PCR扩增插入基因以产生合适的用于连入合适载体的限制性末端

3扩增含目的基因片段通过TA克隆盒进行直接克隆，再将合适的片段亚克隆进所选择

载体

克隆程序：

注意：

如果你要插入pAO815上EcoRI位点，而基因中也含有EcoRI位点，我们建议：

1BsaI可识别以下的限制性识别位点：

5‘GGTCTCN/

3‘CCAGAGNNNNN/

2将EcoRI位点改造成BsaI可识别位点

5‘GGTCTCG/AATTC……

3‘CCAGAGCTTAA/G……

3将该序列通过PCR整合进DNA片段中，或在体外制造其它限制性位点的适配子接头

4用BsaI消化PCR产物或适配连接产物，这样不用EcoRI消化就可产生EcoRI的限制

性末端。

信号序列加工：

Ppic9k中α-factor成熟信号序列加工分两步：

1KEX2基因产物初步切割信号序列，在Glu-lys-arg*glu-ala-glu-ala中星号位置即arg及

glu之间出现Kex2断裂

2STE13基因产物接着切割Glu-Ala重复序列

优化信号切割：

酿酒酵母中，Glu-Ala重复序列并不是Kex2切割时的必需序列，但

Glu-Ala重复序列可使该切割更有效。

Glu-Lys-Arg-X-序列中，在X位置上有许多氨基酸都可替代Glu，如芳香族氨基酸，小

氨基酸及组氨酸。

但脯氨酸会抑制Kex2的切割。

许多情况下，Stel13切割Glu-Ala重复片段效率不高，Glu-Ala重复序列就留在了表达

的目的蛋白的N端，这一般与目的蛋白本身性质有关。

细菌转化：

一旦确定克隆策略，在进行连接反应前应制备好E.coli感受态，可参考电感

受态或化学感受态E.coli方法或使用本实验室实验程序。

Ppic9k的pAOX1及MCS:

特殊考虑：

1目的片段必须克隆进分泌信号序列开放阅读框中

2信号序列中含ATG，翻译从离mRNA5‘端最近的一个ATG开始

3如果插入片段中有BglII位点，毕赤酵母转化时，可选取其它限制性位点来线性化质

粒（P30）

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陈苗商汉桥

转化E.coli：

介绍：

连接反应之后，要通过化学或电转的方法转化E.coli感受态细胞