毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒.docx

1、毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化 基因置换 基因破坏 另外，在酿酒酵

2、母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：His4 基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如His4、Leu2、Arg4、TR11、Ura3 等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动

3、子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶AOX1 及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1 基因已被分离，含AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2 基因与AOX1 基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。表达：AOX1 基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA来自AOX1

4、基因。AOX1 基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1 基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1突变表型： 缺失AOX1 基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts 的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol uti

5、lization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗 商汉桥泌信号序列，利用酿酒酵母因子前原肽信号序列也获得许多成功。 分泌表达外源蛋白的最大优点是：毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着

6、分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成份，也可算作蛋白纯化的第一步。注意，如果外源蛋白一级结构中有可识别的糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr）,则这些位点可能发生糖基化。翻译后修饰： 与酿酒酵母相比，毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有优势，因为不会使其过糖基化。酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型，然而毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。另外，酿酒酵母核心寡糖有末端-1,3聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为酿酒酵母中糖基化蛋白的-1,3聚糖接头与蛋白的超抗原性有关，使得这些蛋白不适

7、于治疗应用。 虽然未经证明，但这对毕赤酵母产生的糖蛋白不构成问题，因为毕赤酵母表达蛋白与高级真核生物糖蛋白结构相似。选择载体用于基因多拷贝整合：在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。该试剂盒中的三个载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。多拷贝插入频

8、率：毕赤酵母His+转化子高拷贝整合事件自发发生的概率为110%，体内方法可筛选可能插入多拷贝外源基因的His+转化子，体外方法可通过连接构建多拷贝子。当选择His+转化子时，它们中插入体外构建结构多聚体的概率很高。体内多拷贝插入的产生：Ppic3.5k 及Ppic9k 含有细菌kan 基因，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，注意Kan 并不赋予毕赤酵母卡那霉素抗性。遗传霉素抗性水平主要依赖整合的kan 基因的数目。单拷贝Ppic3.5k或Ppic9k整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25mg/ml的遗传霉素抗性水平。任何载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平，从0.5mg/ml（1-2 拷贝）

9、到4mg/ml（7-12拷贝）。由于kan基因与表达盒（pAOX1 及目的基因）之间有遗传连锁，可从遗传霉素高抗性推断该克隆所包含多拷贝目的基因数。由于基因的剂量效益，蛋白的表达可能会增加。因此，kan基因可检测转化子是否含有多拷贝目的基因。下图显示多拷贝插入及kan基因与表达盒的连锁。PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗 商汉桥遗传霉素直接选择：在酵母中对遗传霉素抗性进行直接选择并不十分有效，因为新转化的细胞需要时间表达足够量的抗性因子。由于酵母生长比细菌慢得多，大部分重组酵母在积累足够多的抗性因子以抵抗

10、平板上抗生素之前就已经被杀死了。最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。虽然可以用电泳进行直接筛选，但用在遗传霉素筛选之后再进行电泳筛选，获得含高拷贝克隆的机会更大，大约可获得5-9 拷贝的克隆，而直接电泳选择只能获得平均为1-3 拷贝的克隆。原生质转化时不能用遗传霉素直接选择。体外多拷贝插入的产生：下图显示如何产生多表达盒插入载体以转化毕赤酵母。目的基因插入独个EcoRI位点后，产生的表达盒（pAOX1 及目的基因）上下游侧翼分别为独个的BglII 及BamHI位点。含目的基因的pAOX815 用BglII 及BamHI 消化以

11、分离表达盒，表达盒再插入BamHI位点以产生串联重复表达盒，重复该插入程序可产生一系列含单个HIS4 基因及逐渐增加数目表达盒的载体。用体外形成的多拷贝子转化毕赤酵母增加了多拷贝表达盒重组子出现的频率，可设计包含一特定数目多拷贝插入的毕赤酵母重组子。转化及整合：可产生两个不同表型的His+重组菌株：质粒DNA 线性化位置不同，转化GS115 后可产生两种转化子His+Mut+及His+Muts。KM71 只产生His+Muts，因为该菌株为Muts表型。两种重组子Mut及 Muts都是有用的，因为一个表型可能比另一个表型更有利于蛋白表达。理想条件下，每一个表型应该检测6-10 个重组子。没有办

12、法预测哪个结构或克隆更利于蛋白表达。强烈推荐用PCR 分析重组子来证实整合情况。成功将基因构建至AOX1 启动子下游后，线性化质粒转化毕赤酵母时激发重组。下图显示用不同酶消化时产生何种重组子。限制酶 插入事件 GS115 表型 KM71 表型SalI或StuI 插入his4 His+Mut+ 、His+MutsSacI 插入5AOX1 His+Mut+ 、His+MutsBglII 取代AOX1 His+Muts His+Muts（不推荐）PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗 商汉桥表达及扩大培养：用PCR

13、 证实毕赤酵母重组后，可检测His+Mut+及 His+Muts的表达。小规模培养每个重组子，用甲醇诱导，检测时间点.如果是胞内表达，每个时间点细胞沉淀用SDS-PAGE 分析;如果是分泌表达，分析每个时间点的细胞及上清。如果有蛋白的抗体，推荐既用考马斯亮蓝染色又用western blot分析SDS-PAGE凝胶。如果可以,建议检测蛋白活性。因为并不是所有蛋白都能达到g/l 的水平，所以建议进行western blot 或活性分析，不要仅做SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析。如何选择最佳的表达蛋白毕赤酵母菌株及优化诱导见P49-50。如表达已达最优，大规模表达以产生更多蛋白。PDF creat

14、ed with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗 商汉桥方法毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。GS115 及KM71 自发回复突变到His原养生物机率小于1/108。KM71 的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因破坏AOX1 基因后，产生KM71 MutsArg+His-菌株。GS115 及KM71都可在复合培养基如

15、YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。KM71结构：ARG4基因（约2kb）插入到克隆的野生型AOX1 基因的BamHI(AOX1 基因15/16密码子)及SalI(AOX1 基因227/228 密码子)位点。ARG4 取代了AOX1基因16227 密码子。此结构转化至KM71 亲本菌（arg4his4）中,分离Arg+转化子并分析Muts表型。Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1 被aox1:ARG4 结构所取代。重点：用KM71 的优点是，不需要在甲醇最小培养基中筛选Mut 表型。所有转化子都是M

16、uts表型。第二，AOX1 位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换aox1:ARG4 结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长时需精氨酸。不幸的是，仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4 突变的影响，arg4 菌株在含精氨酸的最小培养基中不能很好地生长。因此不推荐在KM71 中通过取代aox1:ARG4 结构来获得His转化子。菌株表达对照：GS115/His+Muts 白蛋白：该菌株为筛选毕赤酵母分泌表达转化子与Muts表型时的对照。血清白蛋白基因及其自身分泌信号被整合进毕赤酵母AOX1 位点。该菌株可分泌白蛋白（67kDa）到培养基中，分

17、泌水平1g/l。GS115/His+Mut+ 半乳糖苷酶：该菌株为筛选毕赤酵母转化子胞内表达与Mut+表型时的对照。半乳糖苷酶（lacZ）基因被整合进毕赤酵母his4 位点，该菌株表达半乳糖苷酶（117 kDa），达到通过SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色或ONPG 分析可测水平。毕赤酵母菌株生长：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。另外注意点有：1 在YPD 中，处于对数期的Mut+、Muts毕赤酵母倍增时间为2小时2 除了在甲醇中生长速度不同外，Mut+、Muts 生长速度没有差别3 甲醇培养基（MM）中，处于对数

18、期的Mut+倍增时间为4-6小时4 甲醇培养基（MM）中，处于对数期的Muts倍增时间为18 小时51OD600=5107细胞/ml注意：生长特性依重组菌株不同而不同PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗 商汉桥在甲醇中生长：当使用甲醇平板或培养基培养时，建议每天添加甲醇以补偿甲醇挥发及消耗。1 平板培养时，在倒置平板盖中加入100ul 100%甲醇2 液体培养时，加入100%甲醇至终浓度为0.5%养基或YPD 琼脂3 部分研究者在进行液体培养时，对Muts 菌株每天加甲醇至浓度为1%，对Mut+菌株每天加甲

19、醇至浓度为3%时，对液体培养没有不良影响。贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0109细胞/ml）3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。注意：在4 度或80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。大肠杆菌菌株：大肠杆菌菌株表型：提

20、供E.coli Top10F以防没有合适的E.coli 菌株。其它合适的菌株为DH5F，JM109 或其它重组缺失菌株（recA），最好是endA，及带有选择性的F附加体。Top10F适用于重组及单链拯救。 如果不需进行单链DNA 拯救，也可用不含F附加体的大肠杆菌菌株。建议：建议冻存Top10F1 在5ml 含50100mg/ml 四环素的LB 中培养Top10F过夜2 取0.85ml培养液加0.15ml灭菌甘油完全混匀3 转入冻存瓶中，冻在液氮或干冰/酒精浴中4 存于80度选择毕赤酵母表达载体：选择载体：如果目的蛋白是细胞溶质型且是无糖基化蛋白，可选择胞内表达蛋白。如果目的蛋白是正常分泌、

21、糖基化蛋白或直接分泌至胞内细胞器内，可尝试分泌表达目的蛋白。建议用体内及体外方法产生并分离外源基因多拷贝插入子。无法预测哪种方法适用于你的蛋白，每种方法的优缺点如下：体外方法 pAO815优点 缺点 可构建特定数目的多拷贝子 克隆特定数目多拷贝子需要更多工作大多数His转化子含有正确的特定数目插入载体可能会很大，与基因大小及插入拷贝数有关筛选多插入子很容易，因为大部分His转化子含有多拷贝目的基因在E.coli中可能会发生重排体外构建可以分析拷贝数对蛋白表达的影响多拷贝插入位于单一位点载体上无需另外的药物抗性标记PDF created with pdfFactory trial version

22、 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗 商汉桥体外方法 Ppic3.5k 或Ppic9k优点 缺点 开始实验比较容易，转化毕赤酵母前载体中只需克隆单拷贝基因定量筛选遗传霉素抗性并不一定与基因拷贝数相关1-10%的His转化子有自发的多拷贝插入筛选His转化子需要做很多工作，因为要从成千上万个His转化子中才能筛选到足够多的遗传霉素抗性克隆进行检测载体平均大小与其它毕赤酵母表达系统相似多拷贝插入的数目不知（尽管可用southern 或dot blot分析方法进行检测）多拷贝插入位于单一位点 遗传霉素筛选对细胞密度敏感，可能会分离到假阳性 特点：下表显示毕赤酵母多拷贝表达载体的一般特点及优点：

23、特点 描述 优点5AOX1 含AOX1 启动子的约1000bp 片段毕赤酵母中可实现甲醇诱导的高水平表达-factor信号序列编码因子信号序列的269bp，用于毕赤酵母分泌表达（只能用于Ppic9k）分泌所需蛋白至培养基中MCS 多克隆位点 在表达载体中插入目的基因TT AOX1 基因自带的转录终止及polyA信号（约260bp）mRNA 有效的转录终止及多聚腺苷酸化HIS4 毕赤酵母野生型基因编码组氨酸脱氢酶（约2.4kb），用于与毕赤酵母his4 菌株进行互补为选择毕赤酵母重组菌株提供选择标记3AOX1 AOX1 基因序列，在TT3远端序列（约650bp）质粒靶向整合进AOX1基因Ampp

24、BR322复制起点Amp 抗性基因E.coli复制起始用于选择、复制及维护E.coli ，BamH， IbglII， NotI，SacI，SalI，StuI单一酶切位点（StuI在Ppic3.5k或Ppic9k中不是唯一的）可线性化载体，使有效插入毕赤酵母基因组产生Mut+或Muts重组子Kan 来自Tn903 的卡那抗性基因，赋予E.coli卡那基因抗性，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性（Ppic3.5k或Ppic9k）通过增加的抗遗传霉素抗性，可在体内筛选多拷贝插入子在大肠杆菌中筛选Kan抗性菌株在该试剂盒中，任何毕赤酵母表达载体都没有酵母复制起始位点。只有当质粒与毕赤酵母基因组发生重组时，才能分

25、离到HIS转化子。Ppic9k：含卡那基因，体内筛选多拷贝子插入，分泌重组蛋白至培养基中。在GS115及KM71 中有功能。PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗 商汉桥1 9276bp 融合载体2 在-factor 分泌信号阅读框中含有用于克隆的4 个单限制酶位点。SnaBI、EcoRI、AvrII、NotI3 -factor 分泌信号分泌表达目的蛋白。表达时，目的基因必须克隆进信号序列起始密码的读码框中毕赤酵母HIS4筛选GS115 或KM71，在AOX1 基因处插入，用SacI 线性化（对于GS115

26、产生His+Mut+，对于KM71 产生His+Muts）在HIS4位点插入，用SalI线性化（对于GS115产生His+Mut+，对于KM71产生His+Muts）在GS115 菌株中，替换AOX1 基因，用BglII线性化（产生His+Muts）克隆进毕赤酵母多拷贝表达载体：介绍：下面列出用这些载体进行克隆策略时应考虑的方针。考虑位点，如用Ppic9k 载体，应考虑将目的基因克隆进-factor信号序列读码框中。建议将3 个超螺旋毕赤酵母表达载体转化E.coli，以便长期保存。1 用灭菌水或TE 缓冲液稀释1ul质粒（1ug/ul）至10-100pg/ul2 取1-2ul稀释质粒转化感受态

27、E.coli，在含50-100 ug/mlAmp 的LB 平板上选择一般考虑：下面是应用pAO815、 Ppic3.5k或Ppic9k 时的一般考虑1 毕赤酵母的密码偏爱与酿酒酵母相同，已证明许多酿酒酵母中基因在毕赤酵母中有交叉功能2 应在含recA, endA 突变的E.coli菌株如Top10F中构建质粒3AOX1mRNA 的5末端在各多克隆位点都已标注出。如需分析RNA，可计算插入基因mRNA 的大小4 插入基因的终止密码子或3AOX1 序列可使翻译有效终止，3AOX1 序列终止密码已标注出PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝

28、表达载体试剂盒制作者：陈苗 商汉桥5 在毕赤酵母及其它真核系统中均发现了“AT 富含区”导致的转录提前终止。如果表达蛋白时出现问题，应检查是否是提前终止及AT 富含区。如要表达基因则需改变基因序列。6Ppic9k中预测的蛋白酶裂解位点如图（p28）所示7 插入成熟基因的开放阅读框，应克隆进-factor 信号序列读码框的下游一般克隆策略：1 连接适合的限制性片段A 直接插入MCS 上两个不同位点B 利用相同的限制性末端，将片段连入单个合适位点2PCR 扩增插入基因以产生合适的用于连入合适载体的限制性末端3 扩增含目的基因片段通过TA克隆盒进行直接克隆，再将合适的片段亚克隆进所选择载体克隆程序：

29、注意：如果你要插入pAO815 上EcoRI位点，而基因中也含有EcoRI 位点，我们建议：1BsaI可识别以下的限制性识别位点：5GGTCTCN/3CCAGAGNNNNN/2 将EcoRI位点改造成BsaI 可识别位点5GGTCTCG/AATTC3CCAGAGCTTAA/G3 将该序列通过PCR 整合进DNA 片段中，或在体外制造其它限制性位点的适配子接头4 用BsaI消化PCR 产物或适配连接产物，这样不用EcoRI消化就可产生EcoRI的限制性末端。信号序列加工：Ppic9k中-factor 成熟信号序列加工分两步：1KEX2 基因产物初步切割信号序列，在 Glu-lys-arg*glu

30、-ala-glu-ala中星号位置即arg及glu之间出现Kex2 断裂2STE13基因产物接着切割Glu-Ala 重复序列优化信号切割：酿酒酵母中，Glu-Ala 重复序列并不是Kex2 切割时的必需序列，但Glu-Ala重复序列可使该切割更有效。Glu-Lys-Arg-X-序列中，在X 位置上有许多氨基酸都可替代Glu，如芳香族氨基酸，小氨基酸及组氨酸。但脯氨酸会抑制Kex2 的切割。许多情况下，Stel13 切割Glu-Ala 重复片段效率不高，Glu-Ala 重复序列就留在了表达的目的蛋白的N 端，这一般与目的蛋白本身性质有关。细菌转化：一旦确定克隆策略，在进行连接反应前应制备好E.coli 感受态，可参考电感受态或化学感受态E.coli 方法或使用本实验室实验程序。Ppic9k的pAOX1及MCS:特殊考虑：1 目的片段必须克隆进分泌信号序列开放阅读框中2 信号序列中含ATG，翻译从离mRNA5端最近的一个ATG 开始3 如果插入片段中有BglII 位点，毕赤酵母转化时，可选取其它限制性位点来线性化质粒(P30)PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗 商汉桥转化E.coli：介绍：连接反应之后，要通过化学或电转的方法转化E.coli感受态细胞