实验四植物抗逆生理.docx
《实验四植物抗逆生理.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验四植物抗逆生理.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
实验四植物抗逆生理
盐胁迫对小麦抗逆生理指标的影响
摘要：
盐胁迫是影响农作物产量及质量的主要非生物因素之一，盐胁迫通过渗透胁迫和离子胁迫以及由此引起的营养不均衡影响植物的生长和发育,破坏植物的生理生化功能,最终导致植物细胞及植物体本身的死亡。
因此,探究盐胁迫对农作物的影响以及盐害机理,提高农作物的耐盐性,从而提高盐渍土的农作物产量及质量,具有重要的理论和现实意义。
土壤溶液中可溶性盐含量的增加将导致溶液渗透压增大,引起植物发生生理干早,从而抑制植物正常生长。
盐胁迫使植物光合速率下降、生长受抑制、衰老加速,其对植物的危害主要包括渗透胁迫和离子胁迫,且渗透胁迫是盐胁迫下最早也是最明显的影响因素。
本实验通过测定：
叶绿素、脯氨酸、膜透性、POD、可溶性糖、MDA。
研究小麦幼苗在盐胁迫的情况下生理的变化。
前言
在农业生产中，作物经常会遇到各种不良的环境条件，如干旱、洪涝、低温、高温、盐渍以及病虫侵染等，这些对植物产生伤害的环境，又称为胁迫也就是植物的逆境。
盐分胁迫主要是由渗透胁迫和离子胁迫组成的在盐分胁迫下植物的外部形态和内部的生理生化特性都发生了一系列的变化，有些变化是盐胁迫伤害的结果，是植物对逆境条件的消极反应，有些变化则是植物对逆境的积极反应，有利于对不利环境条件的适应。
盐分对植物的伤害是多种多样的。
主要包括：
（1）吸水困难：
根吸收水分减少，木质部水势下降，运入生长区的水分减少，因而抑制生长，同时也影响到对其它离子的吸收。
Na+造成土壤导水性能的降低，改变了土壤溶液的渗透势，造成吸水困难，明显降低了植物的叶面积、株高、干物质量，减少了禾本科植物的分蘖数和籽粒数等。
（2）生物膜破坏：
类囊体膜含有大量的糖脂和不饱和脂肪酸，与光化学反应密切相关。
膜脂的不饱和度增加有利于类囊体膜光合特性的维持。
盐胁迫下，Na+可置换细胞膜结合的Ca2+，膜结构遭到破坏，功能改变。
细胞膜选择透性遭到破坏，细胞内的钾、磷和有机溶质外渗，胞外离子如钠、氯大量进入细胞，造成胞内离子平衡破坏。
研究证明NaCl胁迫对植物的伤害主要伤害了细胞的质膜，使膜脂发生过氧化，导致过氧化产物MDA增加，质膜透性加大，细胞内离子平衡失调，代谢紊乱，生长受到抑制。
（3）生理紊乱：
盐分过多会降低蛋白质的合成速率，相对加速储藏蛋白质的水解，造成体内氨基酸的积累过多，产生过多的氧自由基和氨，对植物造成伤害。
盐分过多也抑制光合速率，叶绿体趋于分解，叶绿素被破坏，叶绿素和胡萝卜素的生物合成受干扰，气孔关闭，光合下降。
总之，在盐分胁迫下，植物会产生一些反应，以忍受或适应盐的环境。
1实验材料、试剂与设备
1.1实验原材料
小麦经过不同浓度的盐溶液（0、0.2%、0.4%）处理24h后的新鲜小麦
1.2实验试剂和仪器
1.2.1叶绿素含量测定
95%乙醇（或80%丙酮）；石英砂；碳酸钙粉；
仪器：
剪刀，分光光度计，电子天平，研钵，棕色容量瓶，漏斗，滤纸，吸水纸，胶头滴管。
1.2.2脯氨酸含量测定
2.5%酸性茚三酮溶液的配置：
将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于4℃冰箱中，2-3日有效；3％磺基水杨酸配配制：
3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；6mol/L磷酸：
85%磷酸稀释至原体积的2.3倍；10μg/ml脯氨酸标准母液配制：
精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg/ml脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml，加蒸馏水稀释定容至100ml，即为10μg/ml脯氨酸标准液；100μg/ml脯氨酸母液:
称10mg脯氨酸溶于少量的乙醇中，用蒸馏水定容至100ml；冰醋酸；甲苯。
仪器：
分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。
1.2.3细胞膜透性测定
蒸馏水，去离子水；
仪器：
电导仪，电子天平，三角瓶，吸水纸，剪刀，恒温培养箱，真空泵。
1.2.4过氧化物酶（POD）活性的测定
POD提取液；100mmol/LPH为7.0的磷酸缓冲液PBS；反应混合液：
100mmol/L磷酸缓冲液50ml于烧杯中，加入邻甲氧基苯酚28ul，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19ul，混合摇匀，保存于冰箱中。
1.2.5丙二醛（MDA）含量的测定
10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液；石英砂；
10％三氯乙酸：
称取三氯乙酸55.5556g加水溶解定容至500ml；
0.6％硫代巴比妥酸（用10％三氯乙酸配制）：
称0.6707gTBA加10％TCA溶解定容至100ml（4℃贮存）。
仪器：
离心机，离心管，分光光度计，电子分析天平，恒温水浴，研钵，试管，移液管，试管架，移液管架，洗耳球，剪刀。
1.2.6可溶性糖含量的测定（蒽酮法）
1.材料：
植物叶片。
2.仪器设备：
离心机，离心管，分光光度计，电子分析天平，恒温水浴，研钵，试管，移液管，试管架，移液管架，活性炭，漏斗，剪刀，玻璃棒。
3.试剂
（1）浓硫酸；
（2）80％乙醇。
（3）葡萄糖标准溶液（100μg/mL）：
准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时再稀释10倍（100μg/mL）。
（4）蒽酮试剂：
称取1.0g蒽酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）1000mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2～3周。
2实验设计
将种植的小麦用不同浓度梯度的盐溶液提前24小时预处理，盐溶液的浓度分别为0、0.3%、0.6%，0梯度的作为对照，做三次重复。
3实验步骤
3.1叶绿素含量的测定
1取新鲜植物叶片（或其它绿色组织），擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀；
2称取剪碎的新鲜样品0.2g，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。
静置3～5min；
3取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中；
4用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中,直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至25ml，摇匀；
5把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。
3.2脯氨酸含量的测定
3.3.1脯氨酸标准曲线的制作
1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12ug的脯氨酸标准液。
加入表中试剂后，置于沸水浴中加热20min。
取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
10μg·ml-1脯氨酸标准液（ml）
蒸馏水（ml）
冰醋酸（ml）
2.5﹪酸性茚三酮（ml）
0
2
2
3
0.2
1.8
2
3
0.4
1.6
2
3
0.6
1.4
2
3
0.8
1.2
2
3
1.0
1.0
2
3
2用移液管轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
3标准曲线的绘制
以脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3.3.2样品的测定
1脯氨酸的提取
称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
2测定
吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸、2mlH2O、3ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热20min，溶液即呈红色。
冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml（实际上只吸取了5ml，测定时只用了2ml）；用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
3.3POD酶活性的测定
1取样取0.3g左右的叶片，放在冰凉的研钵下，加入POD提取液4ml，快速研磨，研磨完成后，直接倒入离心管中，放到4℃冰箱冷藏。
（做3次重复）；
2离心调整离心机的转速和时间，12000转下离心6min，离心温度在-4~4℃；
3反应步取上清液40微升（0.04ml）于试管中，加入3ml反应液，混匀，之后放在35℃水浴中保温5min；
4比色在470nm下，用POD提取液作为调零液，测得数据。
3.4膜透性的测定
1选用18个三角瓶，分为三组，每组六个，第一组三角瓶中加入未用KNO3处理的小麦叶片，叶片蒸馏水冲洗干净，然后用吸水纸吸干水分，用剪刀把叶片剪成1cm的小段，每个瓶中准确称量0.5g叶片，再往每个瓶中加入10ml去离子水，六个瓶中三个为A处理，三个为B处理；第二组的六个三角瓶中加入用0.3%梯度KNO3处理过的叶片0.5g，都加入10ml蒸馏水，分成A、B两个处理；用0.6%梯度KNO3处理过的小麦叶片也是同上面的步骤一样；
2把所有的三角瓶抽真空20min；
3测定每组中A处理的电导率；
4将每组B处理的三角瓶用保鲜膜封口，放入恒温培养箱中80℃下处理15min，取出冷却至室温，测定他们的电导率；
3.5丙二醛（MDA）含量的测定
1提取
采用硫代巴比妥酸显色法。
取叶片，洗净擦干后去中脉。
称取0.5g样品，加5%三氯乙酸2mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000rpm，离心10min。
2显色
取上清液2mL，加0.6%TBA2mL，混合后在100℃水浴上煮沸30min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。
分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值。
3.6可溶性糖含量的测定（蒽酮法）
3.6.1可溶性糖的提取
称取0.5g的新鲜植物（青菜）叶片，于研钵中加80%酒精4ml，仔细研磨成匀浆，倒入离心管内，置于80℃水浴中不断搅拌30min，离心10分钟（5000转/min），收集上清液于10ml的刻度试管中，其残渣加2ml80%酒精重复提1次，合并上清液。
在上清液中加0.5g活性炭，80℃水浴脱色30min,定容至10ml，过滤后取滤液（稀释10倍或20倍后）测定。
3.6.2显色及比色
吸取上述糖提取液1mL，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5mL混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。
从标准曲线上查得滤液中得糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。
3.6.3绘制标准曲线
取标准葡萄糖溶液将其稀释成一系列不同浓度的溶液，浓度分别为每mL含糖0、5、10、20、40、60、80μg。
按上述方法分别测得其吸光度，然后绘制A625－糖浓度曲线，或进行直线回归求得直线方程。
试剂（ml）管号
123456
葡萄糖标准液00.050.10.20.30.4
80%酒精1.00.950.90.80.70.6
蒽酮-硫酸试剂555555
葡萄糖浓度（ug/ml）01020406080
3.6.4计算方法
可溶性糖含量% = C*V/（W*106）*100%
V为植物样品稀释后的体积（ml）------100ml
C为提取液的含糖量（μg/ml）--------根据标准曲线计算
W为植物组织鲜重量（g）-------------0.1g
4结果与分析
4.1叶绿素含量的测定
叶绿素含量测定的吸光值如下表1所示
表1提取液吸光度值
重复一
重复二
重复三
0梯度
663nm
0.824
0.607
0.749
645nm
0.299
0.217
0.268
0.2梯度
663nm
1.143
0.964
0.939
645nm
0.572
0.485
0.470
0.4梯度
663nm
0.844
1.097
0.789
645nm
0.404
0.524
0.379
将上述表格中的吸光值代入下面公式，计算出叶绿素含量：
叶绿素a的含量=12.7OD663 -2.69OD645；
叶绿素b的含量=22.9OD645 -4.86OD663；
叶绿素a、b的总含量=8.02OD663 +20.20OD645；
叶绿素a含量如下表2：
表2叶绿素a含量
重复一
重复二
重复三
平均值
0梯度
9.66
7.13
8.79
8.53Aa
0.2梯度
12.98
10.94
10.66
11.53Ab
0.4梯度
9.10
12.52
9.00
10.2Ab
叶绿素A方差分析
差异源
SS
df
MS
F
P-value
Fcrit
组间
1.858467
2
0.929233
0.212392
0.814476
5.143253
组内
26.25053
6
4.375089
总计
28.109
8
通过方差分析可以看出叶绿素A之间不存在显著性差异
叶绿素b含量如下表3：
表3叶绿素b含量
重复一
重复二
重复三
平均值
0梯度
2.84
2.02
2.50
2.45Aa
0.2梯度
7.54
6.42
6.20
6.72Ab
0.4梯度
5.15
6.67
4.84
5.55Aab
叶绿素B方差分析
差异源
SS
df
MS
F
P-value
Fcrit
组间
0.733489
2
0.366744
0.069344
0.933743
5.143253
组内
31.7328
6
5.2888
总计
32.46629
8
通过方差分析F值大于0.05也是不存在显著性差异
叶绿素a、b总含量如下表4：
表4叶绿素a、b总含量
重复一
重复二
重复三
平均值
0梯度
14.93
9.25
11.42
11.87Aa
0.2梯度
20.72
20.43
17.02
19.39Ab
0.4梯度
15.00
19.38
13.98
16.12Ab
叶绿素AB总量含量方差分析：
方差分析
差异源
SS
df
MS
F
P-value
Fcrit
组间
12.70562
2
6.352811
0.334247
0.728401
5.143253
组内
114.0381
6
19.00636
总计
126.7438
8
从上分析可以看出组内不存在显著性差异（F值大于0.05.）上述叶绿素不同浓度盐分情况下都不存在显著性差异，可能是实验过程中的失误造成的。
4.2脯氨酸含量的测定
4.2.1脯氨酸标准曲线绘制
4.2.2样品的测定
不同盐浓度胁迫小麦的脯氨酸甲苯溶液在520nm波长下的吸光值如下表：
表5脯氨酸甲苯溶液在520nm波长下的吸光值
重复一
重复二
重复三
平均值
0梯度
0.101
0.079
0.119
0.100Aa
0.2梯度
0.121
0.161
0.286
0.189Bb
0.4梯度
0.189
0.186
0.2593
0.222Bc
根据上表所述，0梯度的脯氨酸甲苯溶液的吸光值低于0.6梯度的脯氨酸甲苯溶液的吸光值，0.6梯度的脯氨酸甲苯溶液的吸光值高于0.3梯度的脯氨酸甲苯溶液的吸光值，呈现上升的趋势，三组之间差异很明显。
根据上表所述吸光值代入到脯氨酸标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸含量，按照下面的公式计算样品中脯氨酸含量：
脯氨酸含量（ug/gFw）＝
公式中：
X－从标准曲线中查得的脯氨酸含量（ug）；
表6脯氨酸含量
重复一
重复二
重复三
平均值
0梯度
1.044
0.864
1.192
1.033Aa
0.2梯度
1.208
1.536
2.560
1.768Bb
0.4梯度
1.766
1.741
2.35
1.952Cc
方差分析
差异源
SS
df
MS
F
P-value
Fcrit
组间
0.009115
2
0.004558
1.525201
0.291374
5.143253
组内
0.017929
6
0.002988
总计
0.027044
8
根据上述数据方差分析可以看出数据之间无显著差异
4.3细胞膜透性的测定
通过电导仪测定小麦叶片的电导率如下表：
表7小麦叶片的电导率
重复一
重复二
重复三
0梯度
A
2.23
2.02
2.31
B
49.7
49.5
49.4
0.2梯度
A
2.58
2.48
3.80
B
53
50.3
51.5
0.4梯度
A
4.53
4.2
5.18
B
84.9
78.9
97.5
计算按下面公式计算相对电导度，以相对电导度的大小表示细胞膜受伤害的程度。
相对电导度=S1/S2×100%；
式中，S1为A管的电导率，S2为B管的电导率；得出相对电导度如下表：
表8小麦叶片相对电导度
重复一
重复二
重复三
0梯度
4.49%
4.08%
4.68%
0.2梯度
4.88%
4.93%
7.38%
0.4梯度
5.34%
5.32%
5.31%
根据上表所示，细胞膜透性以相对电导度表示，通过上面电导率可以看出在随着浓度上升，电导率是逐渐上升的。
随着电导率的上升，小麦幼苗的膜透性是升高的。
由此可以看出小麦随着膜透性的升高时对小麦生长是不利的。
4.4过氧化物（POD）酶活性测定
通过实验得出酶液在470nm波长下的吸光值如下表：
表9酶液在470nm下的吸光值
重复一
重复二
重复三
0梯度
0.600
0.602
0.851
0.2梯度
0.939
0.750
0.836
0.4梯度
0.648
0.638
0.668
根据上述表格中所示的吸光值代入下面这个公式，计算出过氧化物（POD）酶活性：
过氧化物（POD）酶活性（U/（g˙min））=
；
式中A470为酶液在470nm波长下的吸光值；V1为样品总体积（ml）；W为叶片的重量（g）；V2为测定时所取酶液的体积（ml）；t为反应时间；
所得出过氧化物（POD）酶活性如下表：
表10过氧化物（POD）酶活性
+
重复一
重复二
重复三
0梯度
304
305.013
431.173
0.2梯度
475.76
380
423.573
0.4梯度
328.32
323.253
338.453
通过上表数据显示：
0.2梯度POD酶活性值是最高的，显示比较明显。
重复一和重复二0梯度都小于0.4梯度，可以明显看出盐胁迫情况下随着盐度的升高POD值是上升的，但是0.2浓度梯度和0.4梯度比较，0.2梯度显著高于0.4梯度。
方差分析
差异源
SS
df
MS
F
P-value
Fcrit
组间
5712.033
2
2856.016
0.668442
0.546914
5.143253
组内
25635.89
6
4272.648
总计
31347.92
8
通过方差分析看出不存在显著性差异。
4.5丙二醛（MDA）含量的测定
提取液在532nm、600nm、450nm下的吸光度值如表11所示：
表11提取液的吸光度值
NaCl溶液浓度
1
2
3
0
532nm
0.270
0.374
0.339
600nm
0.114
0.130
0.130
450nm
0.705
0.940
0.853
0.2
532nm
0.370
0.459
0.428
600nm
0.128
0.217
0.134
450nm
0.996
1.230
1.271
0.4
532nm
0.402
0.534
0.648
600nm
0.167
0.244
0.308
450nm
1.323
1.426
1.909
根据公式计得出小麦叶片MDA的含量如表12所示：
表12MDA的含量
NaCl溶液浓度
1
2
3
0
1.559
2.666
2.216
0.2
2.555
2.228
3.019
0.4
1.984
2.737
2.878
4.6可溶性糖含量的测定
4.6.1标准曲线的制作
波长为625nm的吸光度值：
编号
1
2
3
4
5
6
标准液量（ml）
0
0.05
0.10
0.20
0.30
0.40
吸光度值
0
0.010
0.020
0.051
0.057
0.092
图2可溶性糖的标准曲线
如图2所示，标准曲线公式为y=0.2219x-0.0005，R2值达到0.9749，达到了实验多需的要求
4.6.2样品的测定
提取液在波长为625nm下的吸光度值如表12所示：
表13波长为625nm的吸光度值
NaCl溶液浓度
1
2
3
0
0.007
0.003
0.018
0.2
0.088
0.092
0.167
0.4
0.447
0.305
0.194
根据公式计得出小麦叶片可溶性糖的含量如表13所示：
表14可溶性糖的含量
NaCl溶液浓度
1
2
3
0
0.064
0.030
0.157
0.2
0.753
0.787
1.424
0.4
3.805
2.598
1.654
从表中可以看出随着盐分浓度的升高可溶性糖的含量是逐渐升高的，数据比较明显。
当在0.4浓度的情况下，
升级会员 