抗氧化酶测定实验方法.docx
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抗氧化酶测定实验方法
植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定
一、原理
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。
MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。
因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。
丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5—三甲基恶唑-2,4。
二酮），其最大吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ugg-1,根据植物样品量和提取液的体积，加入
Fe3+的终浓度为0.5umolL-1。
二、方法直线回归法MD/与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度
值为零。
不同浓度的蔗糖（0—25mmo卜L-1）与TBA显色反应产物在450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。
UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：
Y532=-0.00198十0.O88D450（44—1）
D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。
三、材料、仪器设备及试剂1、［仪器设备］紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：
10ml1支，2ml1支；剪刀1把。
2、［试剂］
（1）10%三氯乙酸（TCA）;
（2）0.6%硫代巴比妥酸：
先加少量的氢氧化钠（1molL-1）溶
解，再用10％的三氯乙酸定容；石英砂。
四、步骤
1.实验材料受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。
2.MDA的提取称取剪碎的试材1g,加入2mll0%TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加
8mlTCA研磨，匀浆在4000rmin-1离心10min，上清液为样品提取液。
3.显色反应和测定吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。
取上清液测定532、600和450nm波长下的吸光度。
4．计算含量
（1）直线方程法按公式Y532=-0.00198十0.088D450（44—1）
求出样品中糖分在532nm处的吸光度值Y532，用实测532nm的吸光度值减去600nm非特异吸收的吸光度值再减去Y532，其差值为测定样品中MDA—TBA反应产物在532nm的吸光度值。
按MDA在532nm处的毫摩尔吸光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。
MDA（mmo」g-1Fw）二［6.452x（D532-D600）-0.559xD450］xvt/（vs
xw）
式中，Vt:
提取液总体积（mL;
Vs：
测定用提取液体积（ml）;
FW:
样品鲜重（g）。
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性
、目的
学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT光化还原法测定SOD舌力的方法和原理，并了解SOD勺作用特性。
二、原理
SO□是含金属辅基的酶。
高等植物含有两种类型的SODMnnSO［和Cu.Zn—SOD它们都催化下列反应：
由于超氧自由基（Q.—）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD舌性一般为间接方法。
并利用各种呈色反应来测定SOD勺活力。
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子Q.—,当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。
当加入SOD寸，可以使超氧自由基与H结合生成HO和Q,从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。
通过在反应液中加入不同量的SODS液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶舌性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD
抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。
找出SOC抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶舌力单位（U）。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片
2．主要仪器
（1）722型或其他型号的可见分光光度计
（2）万分之一分析天平
（3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：
4500Lux（6）带盖瓷盘1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管5mL数个（10）微烧杯10〜15mL8个/处理（11）移液管或加样器0.5mLX4;1mLX2;2mLX2;5mLX1（12）微量进样器50卩LX2;100卩LX2（13）烧杯50mLX3;100mX5;500mLX1;1000mLX2（14）量筒50mLX1;100mLX2（15）容量瓶50mLX1;
100mLX5;250mLX1;1000mLX2（16）细口瓶125mLX5
3．试剂
（1）0.1mol/LpH7.8磷酸钠（NaHPONaHPQ）缓冲液
A液（0.1mol/LNa2HPQ容液）：
准确称取NqHPQ・I2H2Q（MW=358.143.5814g于100mL小、烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。
4°C冰箱中保存备用。
B液（0.1mol/LNaH2PO溶液）：
准确称取NaHPO•2比0（MW=156.010.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。
4C冰箱中保存备用。
取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液。
4C冰箱中保存备用。
（2）0.026mol/L蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液
准确称取L-蛋氨酸（GHnNOS,MW=149.210.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。
4C冰箱中
保存可用1〜2d。
（3）7.5X10-4mol/LNBT溶液
准确称取NBT（GOHOCbNoQ,MW=817.70.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。
4C冰箱中保存可用2〜3d。
（4）含1.0卩mol/LEDTA的2X10-5mol/L核黄素溶液
A液：
准确称取EDTA（MW=2920.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。
B液：
准确称取核黄素（MW=376.360.0753g于50mL/小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。
C液：
合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/LEDTA的2mmol/L核黄素溶液。
4C冰箱中保存可用8〜10d。
该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4C冰箱中保存。
当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0卩mol/LEDTA的2X10－5mol/L核黄素溶液。
（5）0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液
取0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液50mL移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。
4°C冰箱中保存备用。
（6）石英砂。
四、操作方法和步骤
1．酶液的制备
按每克鲜叶加入3mL0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5mL刻度离心管中，于8500r/min（10000g）冷冻离心30min,上清液即为SOD酶粗提液。
2．酶活力的测定
每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL其中4〜8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。
各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。
其余7个微烧杯均放在温度为25C，光强为4500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。
在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。
以2、3号杯液光密度
的平均值作为抑制NBT光还原率100%，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。
以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。
找出50%抑制率
的酶液量（卩L）作为一个酶活力单位（U）。
表1反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL）
试齐
杯号
试剂
（2）0.026
试剂（5）0.05mol/L蛋氨酸试剂（3）7.5
试剂（4）
1.0卩mol/LEDTA勺2X10"mol/L核黄素溶液
mol/LpH7.8磷（Met）磷酸钠
X10_4mol/L酶液
NBT溶液
酸钠缓冲液
缓冲液
1
0.9
1.5
0.3
0
0.3
2
0.9
1.5
0.3
0
0.3
3
0.9
1.5
0.3
0
0.3
4
0.85
1.5
0.3
0.05
0.3
5
0.80
1.5
0.3
0.10
0.3
6
0.75
1.5
0.3
0.15
0.3
7
0.70
1.5
0.3
0.20
0.3
8
0.65
1.5
0.3
0.25
0.3
五、结果计算
1.560nm波长下各杯液的光密度（表2）
表2测定数据列表
杯号123456782、3号平均值
酶液量（mL）0000.050.100.150.200.25—
光密度（OD60nm）0
抑制率（％）—100100100
以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线。
找出50%抑制率的酶液量（卩L）作为一个酶活力单位
（U）o
2.SO［酶活力按下式计算
VX1000X60
A=
BXWXT
式中各因子代表内容如下:
A:
为酶活力（酶活力单位：
U/g（FW•h）;
V:
为酶提取液总体积（mL;
B:
为一个酶活力单位的酶液量（卩L）;
W为样品鲜重（g）;
T：
为反应时间（min）；
1000:
为1mL=1000卩L;
60:
为1h=60min。
3•抑制率按下式计算
D—D2
抑制率=-—x100%
D
D:
为2、3号杯液的光密度平均值；D2:
为加入不同酶液量的各杯液的光密度值。
注：
有时因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活力工作量将会很大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的光密度值，按下式计算酶活力。
_（D1—D）xVX1000x60
—DXBXWXTX50%
D:
为2、3号杯液的光密度平均值；D:
为测定样品酶液的光密度；
50%:
为抑制率50%;其它各因子代表的内容与上述SOD酶活力计算公式的各因子代表的内容相同。
六、注意事项
1•富含酚类物质的植物（如茶叶）在匀浆时产生大量的多酚类物质，会引
起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此类植物SODS时，必须添加多酚类物质的吸附剂，将多酚类物质除去，避免酶蛋白变性失活，一般在提取液中加1〜4%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP。
2•测定时的温度和光化反应时间必须严格控制一致。
为保证各微烧杯所受光强一致，所有微烧杯应排列在与日光灯管平行的直线上。
过氧化氢酶（CAT）活性
过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力
有一定关系，故常加以测定。
紫外吸收法
一、原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）
随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与设备与试剂】
1、材料
小麦叶片等。
2、仪器设备
研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；
3、试剂
0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
【方法】
1.酶液提取：
称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2〜3ml4C下预冷的pH7.0磷酸
缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并
冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀将量瓶置5C冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm
下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5C下保存备用。
酶活性测定
取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。
^1-1紫外吸收法测样品测定液配制表
管号
S1
S2
SO
空白
粗酶液（ml）
0.4
0.4
04（失液）
04（磷雖冲液）
PH7.8蹦媒神液（ml）
3.0
3.0
3.0
30
蒸谓水（ml）
2.0
20
2.0
2.0
将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。
然后将所有试管在25C预热后，逐管加入0.3ml
0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，
每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算：
以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。
过氧化氢酶活性U/（g.min）=A240―Vt—
O.IxVsXtxW
hNA（AS1+AS2）
丄A240=AsO_
2
式中Aso—加入煮死酶液的对照管吸光值；
Asi,As2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）;
Vi—测定用粗酶液体积（ml）;
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A24o每下降0.1为1个酶活单位（u）;
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
【注】所用H2O溶液及KMnO一溶液临用前需重新标定。
【注意事项】
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚比色法测定）
一、实验原理：
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生
长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这
种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm处的吸光度变化速率来测定过氧
化物酶活性。
二、仪器、药品与材料
1）实验材料
新鲜植物组织。
2）仪器与用品
分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100mL容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁
力搅拌器。
3）试剂
1.愈创木酚。
2.30%过氧化氢。
3.100mmol/L磷酸缓冲液pH6.0（见附录7）。
4.反应混合液：
取100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）50mL于烧杯中，加入愈创木酚28uL于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧
化氢19uL混合均匀，保存于冰箱中备用。
三、实验步骤
1称取植物材料0.1g，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，以4000rpm低温离心15min，上清液即为粗酶液，
定容至10mL刻度，贮于低温下备用。
2•取2支试管，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1
支中加入反应混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。
迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470nm处
测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次。
四、结果计算：
以每分钟OD变化值（AA470/gFWmin）表示酶活性大小，。
也可以用每min
OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。
过氧化物酶活性（U/gFW-min）=△A470WT/WXVSX0.01禾
式中：
△A470——反应时间内OD变化值。
VT――提取酶液总体积（mL）。
W――植物鲜重（g）。
Vs――测定时取用酶液体积（mL）。
t反应时间（min）。
植物组织中蔗糖酶活力的测定DNSfe（3,5-二硝基水杨酸）
一、原理
3,5-二硝基水杨酸3,5-Dinitrosalicylicacid，简称DNS。
在碱性条件下，还原糖与
3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还
原糖则被氧化成糖酸及其它产物。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度
量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样
品中还原糖的含量。
二、仪器与用具：
25ml刻度试管；离心管；100ml玻璃烧杯；100ml三角瓶；刻度吸管1ml、2ml、10ml;
沸水浴；离心机；电子天平；分光光度计；水浴锅；移液枪。
DNS试剂配制
（1）以称取3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）6.3g，氢氧化钠21.0g充分溶解于500ml
蒸馏水中（水先煮沸10分钟后冷却）
（2）加入酒石酸钾钠（C4H4O6KN84H2O）182.0g，苯酚（在50C水中融化）5.0ml,
偏重亚硫酸钠（NaS2O5）5.0g,搅拌至全溶，定容至1000ml。
（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置10天后便可使用。
平时盛一小瓶放在外面使用，
其它储于冰箱中。
此溶液每月配制一次。
注意：
DNS—定要在配制结束后立即转移到小棕色瓶中，同时，使用过程中尽量减少与空气接触。
三、试剂：
1.2mg/ml葡萄糖标准液：
准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80C烘至恒重），
在小烧杯中用蒸馏水溶解后定容至100ml，摇匀，冰箱中保存备用。
2.3,5—二硝基水杨酸（DNS）:
含有将185g酒石酸钾钠溶于300ml的热水中，配成
大约500ml的溶液，将6.3g3,5—二硝基水杨酸和262ml2mol/INaOH加入该热溶液，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌微热溶解。
冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶
备用。
四、实验步骤:
1.可溶性糖的提取：
准确称取烟叶样品0.100g，置于离心管中，加入8ml80%乙醇，
于80C水浴浸提30min，冷却后于4000转离心5min收集上清液，残渣再加入8ml80%乙醇，再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于100ml容量瓶中并用蒸馏水定容至100ml。
2.还原糖的测定：
取提取液1ml于试管中（空白中用1ml蒸馏水代替），加入DNS
试剂1.5ml，摇匀，于沸水浴中加热5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温定容至25ml,
摇匀，然后在540nm波长处比色。
3.标准曲线的绘制：
取干洁25ml试管6支，依次加入葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、
0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入DNS试剂1.5ml,于沸水浴中加热5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25ml刻度处，
摇匀，然后在540nm波长处比色。
4.计算：
还原糖（％）=〔（CW/a）/（WX1000）〕X100
C—标准曲线方程求得的还原糖含量mg数；V—提取液的体积（ml）;
W—样品重量（g）;a—显色时吸取样品液体积（ml）
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