抗氧化酶测定实验方法.docx

1、抗氧化酶测定实验方法植物组织中丙二醛( MDA )含量的测定一、 原 理植物器官衰老或在逆境下遭受伤害， 往往发生膜脂过氧化作用， 丙二醛 (MDA) 是膜脂 过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。 MDA 从膜上产生的位 置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰， 或抑制蛋白质的合成。因此， MDA 的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。丙二醛 (MDA) 是常用的膜脂过氧化指标， 在酸性和高温度条件下， 可以与硫代巴比妥 酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川 (3, 5, 5 三甲基恶唑-2, 4。二酮)，其最大吸收波长在 532nm

2、。但是测定植物组织中 MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与 TBA显色反应产物的最大吸收波长在 450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、 低温等逆境胁迫时可溶性糖增加， 因此测定植物组织中 MDA TBA 反应物质含量时一定要 排除可溶性糖的干扰。 低浓度的铁离子能够显著增加 TBA 与蔗糖或 MDA 显色反应物在 532、 450nm 处的吸光度值，所以在蔗糖、 MDA 与 TBA 显色反应中需一定量的铁离子，通常植 物组织中铁离子的含量为每克千重 100300ugg-1,根据植物样品量和提取液的体积， 加入Fe3+的终浓度为 0. 5umol L-1。二、

3、方法 直线回归法 MD/与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0 25mmo卜L-1)与TBA显色反应产物在 450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制 一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值， 求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见 分光光度计的直线方程为：Y532 = -0. 00198 十 0. O88D450 (44 1)D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及 试剂1、仪器设备紫外可见分光光度计 1台；离

4、心机1台；电子天平1台；10ml离心管4 支；研钵 2 套；试管 4 支；刻度吸管： 10ml1 支， 2ml1 支；剪刀 1 把。2、试剂（1）10 %三氯乙酸（TCA） ; （2） 0. 6 %硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠 （1mol L-1）溶解，再用 10的三氯乙酸定容； 石英砂。四、步骤1.实验材料 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。2. MDA的提取 称取剪碎的试材1g,加入2mll0 %TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA研磨，匀浆在 4000r min-1离心10min，上清液为样品提取液。3. 显色反应和测定 吸取离心的上清液 2ml（对

5、照加2ml蒸馏水），加入2ml 0. 6%TBA溶 液，混匀物于沸水浴上反应 15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定 532、600和450nm 波长下的吸光度。4计算含量（1）直线方程法 按公式 Y532= -0.00198 十 0.088D450 （441）求出样品中糖分在 532nm处的吸光度值 Y532，用实测532nm的吸光度值减去 600nm非特 异吸收的吸光度值再减去 Y532，其差值为测定样品中 MDA TBA反应产物在532nm的吸 光度值。按MDA在532nm处的毫摩尔吸光系数为 155换算求出提取液中 MDA浓度。MDA（mmog-1Fw）二6.452 x （D532

6、-D600）-0.559 x D450 x vt/（vsx w）式中，Vt :提取液总体积（mL ;Vs：测定用提取液体积（ml）;FW:样品鲜重（g）。氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT光化还原法测定SOD舌力的方法和原理， 并了解SOD勺作用特性。二、原理SO是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的 SOD Mnn SO和Cu.Zn SOD它们都催化下列反应：由于超氧自由基（Q. ）为不稳定自由基，寿命极短，测定 SOD舌性一般为 间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD勺活力。核黄素在有氧条件下能产生 超氧自由基负离子Q.,当加

7、入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成 单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长 下有最大吸收。当加入SOD寸，可以使超氧自由基与 H结合生成HO和Q,从而 抑制了 NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入 不同量的SODS液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制 NBT 光还原相对百分率与酶舌性在一定范围内呈正比， 以酶液加入量为横坐标， 以抑 制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据 SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOC抑制NBT光还原相对百分率为 50时的酶量

8、作为一个酶舌力单位（ U）。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片2主要仪器（ 1） 722型或其他型号的可见分光光度计（ 2）万分之一分析天平（3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：4 500Lux （6）带盖瓷盘1个/ 处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管5mL数个（10）微烧杯1015mL 8 个/处理（11）移液管或加样器 0.5mL X 4; 1mLX 2; 2mLX 2; 5mLX 1 （12）微量 进样器 50 卩 LX 2; 100 卩 LX 2 （13）烧杯 50mL X 3; 100mX 5; 500mL X 1; 1 000mLX

9、2 （14）量筒 50mL X 1; 100mLX 2 （15）容量瓶 50mL X 1;100mLX 5; 250mLX 1; 1 000mLX 2 （16）细口瓶 125mL X 53试剂(1)0.1 mol/L pH7.8 磷酸钠(NaHPONaHPQ)缓冲液A液(0.1 mol/L Na 2HPQ容液)：准确称取 NqHPQ I2H2Q (MW=358.14 3.5814g于100mL小、烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入 100mL容量瓶中用蒸馏 水定容至刻度，充分混匀。4 C冰箱中保存备用。B 液(0.1 mol/L NaH 2PO溶液)：准确称取 NaHPO 2比0 (MW=156

10、.01 0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入 50mL容量瓶中用蒸馏水 定容至刻度，充分混匀。4C冰箱中保存备用。取上述A液183mL与 B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8 的磷酸钠 缓冲液。4 C冰箱中保存备用。(2)0.026 mol/L 蛋氨酸(Met)磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸(GHnNOS, MW=149.21 0.3879g于100mL小烧杯中，用 少量0.1 mol/L pH7.8 的磷酸钠缓冲液溶解后，移入 100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀(现用现配)。 4C冰箱中保存可用12d

11、。(3)7.5 X 10 -4 mol/L NBT 溶液准确称取 NBT( GOHOCbNoQ, MW=817.7 0.1533g 于 100mL小烧杯中，用少 量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度， 充分混匀(现配现 用)。4C冰箱中保存可用23d。(4)含 1.0 卩 mol/L EDTA 的 2 X 10 -5 mol/L 核黄素溶液A液：准确称取EDTA( MW=292 0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水 溶解。B液：准确称取核黄素(MW=376.36 0.0753g于50mL/小烧杯中，用少量蒸 馏水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中

12、，用蒸馏水定容至刻度，此溶 液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L核黄素溶液。4C冰箱中保存可用810d。 该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于 4C冰箱中保存。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0卩mol/L EDTA的2 X 10 5 mol/L 核黄素溶液。（5） 0.05 mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液取0.1 mol/L pH7.8 的磷酸钠缓冲液50mL移入100mL容量瓶中用蒸馏水 定容至刻度，充分混匀。4 C冰箱中保存备用。（6） 石英砂。四、操作方法和步骤1酶液的制备按每克鲜叶加入 3mL 0.05 mol/L pH7.8

13、磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂， 于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到 5mL刻度离心管中，于8 500 r/min （10 000g）冷冻离心30min,上清液即为SOD酶粗提液。2酶活力的测定每个处理取 8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表 1 加入各试剂及酶液，反应 系统总体积为3mL其中48号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料 中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。各试剂全部加入后，充分混匀，取 1 号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比 色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25C，光强为4 500Lux的光照箱内 （安装有3根20W的日光灯管）照光15mi

14、n，然后立即遮光终止反应。在 560nm 波长下以 1 号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以 2、3 号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100%，根据其他各杯液的光密度分别计算出不 同酶液量的各反应系统中抑制 NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标， 以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出 50%抑制率的酶液量（卩L）作为一个酶活力单位（U）。表1反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL）试齐杯号试剂（2） 0.026试剂（5） 0.05 mol/L蛋氨酸试剂（3） 7.5试剂（4）1.0 卩 mol/L EDTA勺 2 X 10 mol/L 核黄素溶液m

15、ol/L pH7.8 磷（Met）磷酸钠X 10_4mol/L 酶液NBT溶 液酸钠缓冲液缓冲液10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.340.851.50.30.050.350.801.50.30.100.360.751.50.30.150.370.701.50.30.200.380.651.50.30.250.3五、结果计算1. 560nm波长下各杯液的光密度（表 2）表2测定数据列表杯 号 1 2 3 4 5 6 7 8 2、3号平均值酶液量（mL） 0 0 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 光密度（OD60nm） 0抑制率（

16、） 100 100 100以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸 上绘制出二者相关曲线。找出50%抑制率的酶液量（卩L）作为一个酶活力单位（U）o2. SO酶活力按下式计算V X 1000 X 60A =B X W X T式中各因子代表内容如下:A:为酶活力（酶活力单位：U/g （ FW h）;V:为酶提取液总体积（mL ;B:为一个酶活力单位的酶液量（卩L）;W为样品鲜重（g）;T：为反应时间（min）；1 000 :为 1mL = 1 000 卩 L;60:为 1h = 60min。3 抑制率按下式计算DD2抑制率=-x 100%DD:为2、3号杯液的光密度平

17、均值；D2:为加入不同酶液量的各杯液的光密 度值。注：有时因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活力工作量将会很 大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的光密度值，按下式计算酶活力。_ （D1 D） x V X 1000 x 60 DX B X W X T X 50 %D:为2、3号杯液的光密度平均值；D:为测定样品酶液的光密度；50% :为抑制率50% ;其它各因子代表的内容与上述 SOD酶活力计算公式 的各因子代表的内容相同。六、注意事项1富含酚类物质的植物（如茶叶）在匀浆时产生大量的多酚类物质，会引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此类植物SODS时，必须添加 多酚类物质

18、的吸附剂，将多酚类物质除去，避免酶蛋白变性失活，一般在提取液 中加14%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP。2测定时的温度和光化反应时间必须严格控制一致。为保证各微烧杯所受 光强一致，所有微烧杯应排列在与日光灯管平行的直线上。过氧化氢酶（CAT）活性过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中， 其活性与植物的代谢强度及抗寒、 抗病能力有一定关系，故常加以测定。紫外吸收法一、原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢， 使反应溶液吸光度（A 240）随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与设备与试剂】1 、材料小麦叶片等。2、 仪器设备研钵；离心机；

19、250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴； 紫外分光光度计；3、 试剂0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H 2O2 （用 0.1mol/L 高锰酸钾标定）。【方法】1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织 0.5g置研钵中，加入23ml 4 C下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置 5 C冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。 5C下保存备

20、用。酶活性测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。1-1紫外吸收法测样品测定液配制表管号S1S2SO空白粗酶液（ml）0.40.404（失液）04（磷雖冲液）PH7.8蹦媒神液（ml）3.03.03.030蒸谓水（ml）2.0202.02.0将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在 25 C预热后，逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中， 240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。3.结果计算：以每分钟A240减少0

21、.1的酶量为1个酶活单位（U）。过氧化氢酶活性 U/（g.mi n）= A240VtO.IxVsXtxWhN A （ AS1 + AS2）丄 A240= AsO_2式中 A so加入煮死酶液的对照管吸光值；Asi, As2样品管吸光值；Vt 粗酶提取液总体积（ml）;V i测定用粗酶液体积（ml）;FW 样品鲜重（g）；0.1 A24o每下降0.1为1个酶活单位（u）;t加过氧化氢到最后一次读数时间（ min ）。【注】 所用H2O溶液及KMnO一溶液临用前需重新标定。【注意事项】凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚比色法测定）一、 实验原理：

22、过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系， 在植物生长发育过程中， 它的活性不断发生变化， 因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质 在470 nm处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。二、 仪器、药品与材料1） 实验材料新鲜植物组织。2） 仪器与用品分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。3） 试剂1 .愈创木酚。2.30%过氧化氢。3.100 m

23、mol/L磷酸缓冲液 pH 6.0 （见附录7）。4 .反应混合液：取 100 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.0 ） 50 mL于烧杯中，加入愈创木 酚28 uL于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 %过氧化氢19 uL混合均匀，保存于冰箱中备用。三、 实验步骤1称取植物材料 0.1 g，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残 渣再用5 mL磷酸缓冲液提取一次，以 4000 rpm低温离心15 min，上清液即为粗酶液，定容至10 mL刻度，贮于低温下备用。2取2支试管，于1只中加入反应混合液 3 mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反

24、应混合液 3 mL和上述酶液1mL （如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中 溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内， 立即开启秒表记录时间， 于470 nm处测定吸光度（OD ）值，每隔10S读数一次。四、结果计算：以每分钟OD变化值（AA470 / gFW min ）表示酶活性大小，。也可以用每 minOD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。过氧化物酶活性（U/gFW- min） = A470WT/WX VSX0.01 禾式中： A470反应时间内OD变化值。VT 提取酶液总体积（mL ）。W 植物鲜重（g ）。Vs 测定时取用酶液体积（mL ）。t 反应时间（m

25、in ）。植物组织中蔗糖酶活力的测定 DNSfe（ 3,5-二硝基水杨酸）一、 原理3, 5-二硝基水杨酸 3,5-Dinitrosalicylic acid，简称 DNS。在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为 3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在 540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。二、 仪器与用具：25ml刻度试管；离心管；100ml玻璃烧杯；100ml三角瓶；刻度吸管 1ml、2ml、10ml;沸水浴

26、；离心机；电子天平；分光光度计；水浴锅；移液枪。DNS试剂配制（1）以称取3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7 ） 6.3 g，氢氧化钠21.0 g充分溶解于500 ml蒸馏水中（水先煮沸 10分钟后冷却）（2） 加入酒石酸钾钠（C4H4O6KN8 4H2O ） 182.0g，苯酚（在50C水中融化） 5.0 ml,偏重亚硫酸钠（NaS2O5） 5.0g,搅拌至全溶，定容至 1000 ml。（3） 充分溶解后盛于棕色瓶中，放置 10天后便可使用。平时盛一小瓶放在外面使用，其它储于冰箱中。此溶液每月配制一次。注意：DNS 定要在配制结束后立即转移到小棕色瓶中，同时，使用过程中尽量减少 与空气接

27、触。三、 试剂：1.2mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80 C烘至恒重），在小烧杯中用蒸馏水溶解后定容至 100ml，摇匀，冰箱中保存备用。2.3,5二硝基水杨酸（DNS）:含有将185g酒石酸钾钠溶于 300ml的热水中，配成大约500ml的溶液，将6.3g 3,5 二硝基水杨酸和 262ml 2mol/INaOH加入该热溶液，再 加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌微热溶解。冷却后加蒸馏水定容至 1000ml，贮于棕色瓶备用。四、 实验步骤:1. 可溶性糖的提取：准确称取烟叶样品 0.100g，置于离心管中，加入 8ml80%乙醇，于80 C水浴浸提30min，冷

28、却后于4000转离心5min收集上清液，残渣再加入8ml80%乙醇， 再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于 100ml容量瓶中并用蒸馏水定容至 100ml。2. 还原糖的测定：取提取液 1ml于试管中（空白中用 1ml蒸馏水代替），加入 DNS试剂1.5ml，摇匀，于沸水浴中加热 5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温定容至 25ml,摇匀，然后在540nm波长处比色。3. 标准曲线的绘制：取干洁25ml试管6支，依次加入葡萄糖标准液 （1mg/ml） 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml 和蒸馏水 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入 DNS 试剂 1.5ml, 于沸水浴中加热 5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至 25ml刻度处，摇匀，然后在540nm波长处比色。4. 计算：还原糖（） =（ CW/a） /（W X1000）X100C标准曲线方程求得的还原糖含量 mg数； V 提取液的体积（ml）;W样品重量（g） ; a 显色时吸取样品液体积（ml）